响应面分析法优化平菇液体菌种培养基的研究

王永立,谷志想

(周口师范学院生命科学与农学学院,河南 周口 466001)

响应面分析法优化平菇液体菌种培养基的研究

王永立,谷志想

(周口师范学院生命科学与农学学院,河南 周口 466001)

以平菇为研究对象,用菌丝体干重作为考查目标,筛选平菇液体菌种培养基.在单因素实验的基础上,利用Plackett-Burman实验确定影响平菇菌丝体干重的关键因素.以玉米粉、麸皮和KH2PO4为自变量,菌丝体干重为响应值,根据Box-Behnken中心组合设计原理,研究各自变量及交互作用对菌丝体干重的影响,得出平菇液体菌种最适培养基配比:玉米粉5.00％、麸皮4.50％、KH2PO40.25％.在此条件下,菌丝体干重实测可达9.640 g/L,与理论预测值9.752 g/L相比,其相对误差为1.15％.说明响应面预测模型具有一定的可靠性.

平菇;菌丝体;培养基;响应面法

平菇(Pleurotus ostreatus),属担子菌亚门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属,其肉质肥厚、口感脆嫩、味道鲜美、低脂且营养丰富,深受人们喜爱[1-2].2012年中国平菇产量为533万吨,占全国食用菌总产量的18.85％,是中国食用菌产业的重要组成部分.由于平菇具有较高的膳用、药用价值,深受消费者青睐,市场需求量较大[3].

目前中国栽培平菇的方法很多,有瓶栽、箱筐栽培、袋栽、室内大床栽培、阳畦栽培、段木栽培和连续生产工艺等[1].平菇栽培多选用固体菌种,但固体菌种的生产周期较长,工艺相对繁琐,需要大量的人力、物力.而液体菌种生产周期短、制作简单、使用方便、生长速度快、菌龄一致、菌种纯度高、接入栽培料后菌丝萌发迅速,更适于规模化生产[4-6].液体菌种的生产主要取决于培养基配比是否优良,它直接决定着液体菌种质量的优劣,影响着平菇的产量和经济效益[1].笔者通过单因素实验对平菇液体培养基碳源和氮源进行筛选,在此基础上,利用响应面分析确定适合平菇菌丝生长的液体种子培养基最佳配方,旨在为平菇液体菌种生产提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

平菇831菌株,购自周口市农业科学院食用菌研究中心;马铃薯、玉米粉、麸皮、豆粕,市售;葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂、MgSO4、KH2PO4、ZnSO4、蛋白胨、甘露醇、乳糖、硝酸铵、硫酸铵、酵母膏等均为分析纯.

斜面加富培养基:马铃薯20％、蔗糖2％、琼脂2％、KH2PO40.1％、VB20.001％;碳源基础培养基:蛋白胨1.0％,MgSO40.15％,KH2PO40.1％,VB10.001％;氮源基础培养基:葡萄糖2.0％,Mg-SO40.15％,KH2PO40.1％,VB10.001％;供试碳源为葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉;供试氮源为蛋白胨、豆粕、麸皮、酵母膏、硝酸铵和硫酸铵.

1.2 方法

1.2.1 斜面菌种的活化

无菌条件下,将平菇831菌种转接至斜面培养基上,置于26℃条件下培养10 d,挑选菌丝健壮、无污染的斜面菌种备用[7-8].

1.2.2 最适碳源、氮源筛选

以100mL碳源基础培养基和氮源基础培养基为基质,依次分别添加葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、玉米粉、可溶性淀粉,豆饼粉、麸皮、酵母膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵,上述物质添加量均为2.5 g.每个处理设置3个重复,充分混均后,0.1 Mpa压力下灭菌30 min.无菌条件下,取约2 cm2生长旺盛的斜面菌种块,分别接种于各培养基中,置于26℃,150 r/min振荡培养7～8 d,观察菌丝生长状况,测定菌丝体干重[8].

1.2.3 响应面法优化培养基

(1)Plackett-Burman(PB)实验确定关键因素:对影响实验结果的主要因素进行PB实验设计,每个因素取高低两水平,响应值为平菇菌丝体干重(Y).借助Design-Expert 9.0.3软件对结果进行方差分析,确定影响实验结果的关键因素[9-10].

(2)最陡爬坡法确定关键影响因素的水平:以实验值变化的梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值大小确定变化步长,逼近最佳值区域,进而确定关键因素的水平[9].

(3)Box-Behnken Design(BBD)实验设计:根据Box-Behnken中心组合设计原理,设计3因素3水平的响应面实验,对影响菌丝体干重的3个关键因素进一步研究,寻求最佳的实验条件以及因素间的交互作用,从而获得平菇液体菌种最佳培养基组分[11].

1.3 数据处理

借助Design-Expert 9.0.3统计分析软件进行多元二次回归模拟方程的构建及方差分析,并获取响应面最大值时培养基各组分的最适水平[10].

2 结果与分析

2.1 培养基最适碳源的选择

结果表明:平菇液体菌种能够利用多种碳水化合物,但利用效果有差异.由图1可知,在不同碳源液体培养基中平菇菌丝干重大小依次为:玉米粉＞可溶性淀粉＞葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞甘露糖.玉米粉来源广泛,价格低廉,是大规模生产平菇液体菌种的最适原料,因此选择玉米粉作为平菇液体菌种培养基的碳源.

2.2 培养基最适氮源的选择

结果表明:平菇菌丝体能利用不同种类的氮源,且对有机氮的利用明显好于无机氮.由图2可知,不同氮源液体培养基中平菇菌丝干重大小依次为:麸皮＞酵母膏＞蛋白胨＞豆粕＞硝酸铵＞硫酸铵.因此选择麸皮作为平菇液体菌种培养基的氮源.

图1 不同碳源对平菇菌丝体干重的影响

2.3 PB实验筛选主要影响因子

在单因素实验的基础上,选择影响实验结果的酵母膏、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮、MgSO4、KH2PO4、ZnSO4和VB1等8个实际因素和3个虚拟因素进行PB实验设计(N=12),响应值为菌丝干重,实验设计、结果及效应分析分别见表1、表2和表3.

图2 不同氮源对平菇菌丝体干重的影响

表1 Plackett-Burman实验设计各因素及水平

如表3所示,玉米粉、麸皮、KH2PO4对菌丝干重影响较大,其中玉米粉表现为正效应,麸皮和KH2PO4为负效应.因此考虑将上述3因素作为影响平菇菌丝体干重的关键因素,进一步分析.

表2 Plackett-Burman实验设计和结果

表3 Plackett-Burman实验因素及显著性分析

2.4 最陡爬坡实验

结合PB实验结果设计最陡爬坡实验,见表4.结果表明,最优条件在第3组附近.因此以第3组实验值作为响应面试验的中心点,即玉米粉4.5％,麸皮4.5％,KH2PO40.25％.

表4 最陡爬坡实验设计及结果

2.5 BBD响应面实验

结合最陡爬坡实验结果,进行BBD实验设计(见表5).借助Design-Expert 9.0.3软件对BBD实验结果进行统计分析,结果见表6.由表6知,模型决定系数R2=91.66,表明实测值与预测值相关度高;模型P=0.004 9＜0.01,说明模型差异极显著,其中B、C、B2、C2极显著,AC显著;失拟项P＞0.05,差异不显著,说明残差均由随机误差引起,该模型拟合度较好,可以用此模型分析和预测响应值变化[12].

表5 BBD实验设计及结果

利用Design-Expert 9.0.3软件对表5实验结果进行回归拟合,得回归方程:Y=9.05+0.57A-0.070B+0.38C+0.11AB-0.45AC+0.023BC+ 0.13A2-0.55B2-0.52C2

2.6 响应面分析及优化

根据回归分析结果做出各关键因素及其交互作用对响应值的影响,由响应面平面投影形状确定关键因素之间交互作用的强弱[13].由图3～图5可知,玉米粉和麸皮、玉米粉和KH2PO4之间有明显的交互作用.通过对回归模型分析知,影响平菇菌丝体干重的液体培养基最佳配比为玉米粉5.000％、麸皮4.516％、KH2PO40.247％.在此条件下,平菇菌丝体干重为9.752 g/L.为检验响应面法所得结果的准确性和可靠性,考虑到实际操作的便利,将上述配比修正为玉米粉5.00％、麸皮4.50％、KH2PO40.25％,在此条件下实测得到的平菇菌丝干重可以达到9.640 g/L,相对误差为1.15,从而证明该模型预测的可行性.

表6 模型方差分析表

图3 玉米粉和麸皮对菌丝体干重影响的响应面图

图4 玉米粉和磷酸二氢钾对菌丝体干重影响的响应面图

3 讨论

单因素实验和正交设计法常被用于蕈类菌种培养基参数的优化,但单因素实验存在费时、忽视不同因素相互作用关系的缺点;而正交试验只能分析所取的水平值,无法在给出的整个区域内找到因素和水平值之间的关系,只能得到所设定值的最优组合.响应面法则克服上述两种方法的不足,在所取水平的整个区域进行筛选,大大增加了试验目的的可能性,分析结果更准确[14].

本研究通过单因素试验,分别从六种碳源和六种氮源中筛选出对平菇菌丝生长适宜的碳源(玉米粉)和氮源(麸皮).然后通过Plackett-Burman实验确定影响平菇菌丝体干重的关键因素.在此基础上进行了最陡爬坡实验,确定了最佳响应面区域,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,设计3因素3水平实验,利用Design-Expert软件进行响应面分析,建立了玉米粉、麸皮和磷酸二氢钾等3个关键因素与平菇菌丝干重之间的数学模型,研究利用响应面法确定平菇液体菌种培养基配比的可行性.结果表明,本研究建立的模型回归效果显著,方程合理可靠,能很好地预测平菇菌丝体干重.关键因素最适浓度为:玉米粉5.00％、麸皮4.50％、磷酸二氢钾0.25％,菌丝体预测干重为9.752 g/L.经验证,在此优化条件下实测平菇菌丝体干重可达9.640g/L,与理论值基本吻合,说明以菌丝体干重为指标,利用响应面法寻求平菇液体菌种培养基最佳配比是切实可行的.

图5 麸皮和磷酸二氢钾对菌丝体干重影响的响应面图

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Study on optimization of liquid seed culture medium of Pleurotus ostreatus by response surface methodology

WANG Yongli,GU Zhixiang
(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Pleurotus ostreatus as the research object,with the dry weigh of mycelium as a measure indicator,three parameters including corn flour,wheat bran and KH2PO4were optimized using the Plackett-Burman design and Box-Behnken certral composite design based on single factor investigations for optimizing the components of liquid strain culture medium ofPleurotus ostreatus.The results showed that the optimal medium were corn flour 5.00％,wheat bran 4.50％,KH2PO40.25％.Under the conditions,the dry weight of mycelia reached 9.640 g/L,compared with the theoretical predicted value of 9.752 g/L,the relative error was 1.15％.It was indicated that the reliability of the model was proved fully.

Pleurotus ostreatus;mycelium;culture medium;response surface methodology

Q935

:A

:1671-9476(2015)05-0129-05

10.13450/j.cnkij.zknu.2015.05.033

2015-06-20;

:2015-07-19

河南省教育厅科学技术研究资助项目(No.12B230019)

王永立(1978-),男,河南西平人,硕士,讲师,主要从事微生物学研究.