隐丹参酮对人胃癌SGC—7901细胞增殖及血管内皮生长因子mRNA表达的影响

邓凤春++++++于占江++++++杨钰等

1.齐齐哈尔医学院解剖教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院第三附属医院普外科，

黑龙江齐齐哈尔 161001；3.齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006

[摘要] 目的 通过测定隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的影响，探讨其抗肿瘤的作用机制。 方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，采用Real Time RT-PCR检测隐丹参酮对VEGF mRNA表达的影响。 结果 20、40、60、80、100 μmol/L的隐丹参酮作用于人胃癌SGC-7901细胞6～48 h，其生长和增殖均受到一定程度的抑制；24 h为隐丹参酮对SGC-7901细胞抑制作用的最佳时间，IC50为59.11 μmol/L；选取40、60和80 μmol/L 3个剂量作用于人胃癌细胞SGC7901 24 h后，60和80 μmol/L的隐丹参酮均可下调VEGF mRNA的表达（均P < 0.01）。 结论 隐丹参酮可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，并能抑制VEGF mRNA的表达，提示这可能是其抗肿瘤的作用机制之一。

[关键词] 隐丹参酮；人胃癌SGC-7901细胞；四甲基偶氮唑蓝；血管内皮生长因子；实时荧光定量PCR

[中图分类号] R735.2，R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（c）-0007-04

隐丹参酮（cryptotanshinone，CPT）是从活血化瘀中药丹参中提取出的有效成分，可以诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞凋亡，能够在一定程度上阻碍肿瘤细胞侵袭和防止其向远处转移，具有抗肿瘤细胞的活性，且抗瘤谱较广，日益受到关注[1]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前最重要的血管生成刺激因子之一，在肿瘤的生长与转移中起着重要作用，可诱导体外内皮细胞的增殖和迁移及体内血管生成[2]。本研究检测不同浓度的隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞增殖及VEGF mRNA表达的影响，探讨隐丹参酮抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 药品及试剂

隐丹参酮购自上海源叶生物科技有限公司（HPLC≥98%）；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料研究所；RPMI 1640培养基及细胞消化液胰酶（Tyrisin）为美国Gibco公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均为美国Sigma公司产品；VEGF和β-肌动蛋白（β-actin）引物由TAKARA公司合成；RNAiso Reagent、PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒及SYBR？誖Premix Ex TaqTM试剂盒均为TAKARA公司产品。

1.1.3 主要仪器

倒置显微镜（IMT-2）产自Olympus公司；超净工作台产自苏州安泰空气技术有限公司；CO2孵箱产自Thermo Electron公司；-80℃超低温冰箱产自日本SANYO公司；酶标仪产自美国Bio-rad公司；7300 Real Time PCR System产自美国Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制试验（MTT法）

隐丹参酮用DMSO配成一定浓度的储备液，过滤除菌，分装冻存，临用再前用培养液稀释成所需浓度，DMSO的终浓度≤0.1% （V/V）。

取对数增长的SGC-7901细胞，以1×104个/孔的密度接种于96孔板内，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞稳定生长4 h后，设空白对照组和5个不同浓度的隐丹参酮组（终浓度为20、40、60、80、100 μmol/L），每种浓度5个复孔。除空白对照组外，每孔中加入相应浓度的隐丹参酮，分别刺激6、12、24、48 h后，加入0.5%MTT溶液，继续培养4 h；小心吸去培养液；每孔加入150 μL DMSO，置37℃、5% CO2细胞培养箱培养10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm/630 nm（主波长570 nm，参比波长630 nm）测量各孔的吸光值并计算抑制率。抑制率=（对照组OD值-用药组OD值）/对照组OD值×100%。每组去掉一个OD值最低值和一个最高值，取剩余3个复孔OD值来计算。

1.2.2 荧光实时定量PCR

取对数增长的SGC-7901细胞，以1×104个/孔的密度接种于6孔板内，待细胞稳定生长4 h后，设空白对照组和3个不同浓度的隐丹参酮组（终浓度为40、60、80 μmol/L）；于37℃、5% CO2培养箱中，孵育24 h，收取各组细胞用Real Time RT-PCR方法检测细胞的VEGF mRNA的表达。

1.2.2.1 抽提总RNA 按RNAiso Reagent操作说明书提取各组细胞的总RNA，紫外分析及电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。

1.2.2.2 单链cDNA的合成 采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒，严格按说明书操作。各目的基因的引物序列[3]及产物大小如下：VEGF：Forward 5'-TTG-CTGCTCTACCTCCAC-3'，Reverse 5'-AATGCTTTCT-CCGCTCTG-3'，417 bp；β-actin：Forward 5'-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3'，Reverse 5'- TCTCCTTAA-TGTCACGCACGA-3'，252 bp。

1.2.2.3 Real Time PCR 采用SYBR？誖Premix Ex TaqTM试剂盒，应用ABI 7300 Real Time PCR System采用两步法PCR反应程序：预变性 95 ℃，10 s（1个循环）；PCR反应 95 ℃，5 s，60 ℃，31 s（40个循环）。

1.2.2.4 产物分析 使用Sequence Detection software version 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的阈循环（Threshold cycle，CT），阈循环值随模板浓度增大而减少。每个样本均设5个复孔，内参照基因亦设5个复孔。采用2-△△■的方法[4]分析VEGF mRNA表达水平（△CT=CT 目的基因-CT β-actin，△△CT=△CT各干预组-△CT空白对照组）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞生长增殖的影响

以20、40、60、80、100 μmol/L的隐丹参酮作用于SGC-7901细胞6～48 h后，采用MTT法检测细胞的增殖抑制情况。实验表明，隐丹参酮能明显抑制SGC 7901细胞的增殖，随着药物浓度及作用时间的增加，抑制作用也逐渐增强，尤以刺激24 h和48 h明显，呈剂量与时间依赖性。由于刺激48 h后，最低浓度的隐丹参酮对SGC-7901细胞的抑制率已超过50%，故选取24 h作为隐丹参酮对SGC-7901细胞抑制作用的最佳时间。见表1。

刺激24 h后，隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用与药物浓度之间呈线性关系（y = 0.498x+20.56，R2=0.972），并由此计算出隐丹参酮对SGC-7901细胞的半数抑制浓度（IC50）为59.11 μmol/L，故选取40、60、80 μmol/L 3个剂量作为后续实验中隐丹参酮的给药浓度。

表1 不同浓度隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞的

抑制作用（%，x±s，n = 3）

2.2 隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞VEGF mRNA表达的影响

以40、60、80 μmol/L的隐丹参酮作用于SGC-7901细胞24 h后，通过2-ΔΔ■法计算各组SGC-7901细胞VEGF mRNA的表达水平，见表2。

由表2和图1可见，与空白对照组相比，40 μmol/L隐丹参酮组的VEGF mRNA的表达量虽有所减低，但差异无统计学意义（P > 0.05），而60 μmol/L和80 μmol/L隐丹参酮组的VEGF mRNA的表达量均较空白对照组明显降低（均P < 0.01），且有随药物浓度的增加而逐渐减少的趋势，其量效曲线呈对数关系，y = -0.6854Ln（x）+3.3759，R2=0.9884。

表2 不同浓度隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞

血管内皮生长因子mRNA表达的影响（x±s，n = 5）

注：与空白对照组比较，**P < 0.01；与40 μmol/L隐丹参酮组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；VEGF：血管内皮生长因子；CT：阈循环

VEGF：血管内皮生长因子

图1 隐丹参酮对人胃癌SGC-7901细胞VEGF mRNA表达的

量效曲线

3 讨论

胃癌在全世界的发病率都很高，根治性切除术是目前唯一可以治愈胃癌的方法，但大部分患者术后会发生局部复发或远处转移[5]。因此，研究更有效的治疗药物以延长患者的生存期，提高患者的生活质量一直是备受关注的热点。

中药以其天然、毒副作用小的优势为抗肿瘤研究提供了新的思路和方法。隐丹参酮是中药丹参中具有很强代表性的脂溶性有效组分。大量研究证实，隐丹参酮具有广谱的胞毒效应，如黑色素瘤、胆管癌、白血病等[6-8]，故其在肿瘤治疗方面具有较大的临床药用开发价值。本研究发现，隐丹参酮能明显抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，药物作用显示出显著的剂量-时间-效应依赖关系；且24 h为隐丹参酮对SGC-7901细胞抑制作用的最佳时间，IC50为59.11 μmol/L。

肿瘤血管的生成是肿瘤无限增殖和转移的必要条件[9]，而肿瘤血管的生成是由一系列促血管生成因子而引发和维持的病理血管生成过程。VEGF是目前最重要的促血管生成因子之一，且在肿瘤组织中有较高表达[10-11]。抑制VEGF的表达不但可以抑制肿瘤的生长，还可以抑制肿瘤的侵袭和转移，故抗肿瘤血管生成可能成为治疗肿瘤新的方法。卞维鹏等[12]研究表明，隐丹参酮是一种新的小分子血管生成抑制剂，由此推测隐丹参酮可能通过抑制血管生成起到一定的抗肿瘤作用。本研究发现，以不同浓度的隐丹参酮（40、60、80 μmol/L）作用于人胃癌SGC-7901细胞24 h后，经Real Time RT-PCR法检测后表明：VEGF mRNA表达下调，且随药物浓度的增加而逐渐减少。

综上所述，隐丹参酮不仅能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，还能通过抑制肿瘤细胞VEGF mRNA的表达而具有潜在的抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用，但机制尚不十分清楚。随着研究的不断深入，将会更深层次地探究隐丹参酮抑制肿瘤细胞增殖及抗肿瘤血管生成的分子机制。

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[4] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method [J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[5] 苏丹，张婷婷，王李杰，等.胃癌抗血管生成靶向治疗的研究进展[J].中国医药导报，2012，9（9）：14-18.

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[7] 陈春雷，弓建华，缪辉来，等.隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖、survivin基因及caspase-3蛋白表达的影响[J].广东医学院，2013，31（1）：4-7.

[8] 罗聪，刘加军.隐丹参酮对U937细胞的生长抑制作用及机制[J].山东医药，2012，52（21）：14-16.

[9] 刘红英.胃癌组织中三叶因子、环氧化酶、血管内皮生长因子的表达及其意义[J].中国医药导报，2012，9（16）：58-59，65.

[10] 钟崇，郭荣平，石明，等.VEGF与MMP-9在肝癌组织中的表达及其临床意义[J].癌症，2006，25（5）：599-603.

[11] 雷杰，费建东，刘振显，等.乳腺癌组织中Ang-2及VEGF的表达及意义[J].肿瘤防治研究，2008，35（4）：263-265.

[12] 卞维鹏，徐莹，陈菲，等.隐丹参酮对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用[J].中国微循环，2007，11（1）：23-26.

（收稿日期：2014-11-24 本文编辑：程 铭）