梯度剂量放射对兔髁状突组织学结构影响的研究

廖云阳， 张纬建， 陈芳川， 邱　宇， 林李嵩

梯度剂量放射对兔髁状突组织学结构影响的研究

廖云阳， 张纬建， 陈芳川， 邱宇， 林李嵩

摘要:目的采用梯度剂量放射线照射兔颞下颌关节，动态观察研究兔髁状突的组织学改变。方法取新西兰兔63只，分为未放疗组和放疗组，未放疗组作为空白对照，不做任何处理，用于收集正常颞下颌关节资料；放疗组兔随机分为A～F 6个剂量组，采用梯度剂量行颞下颌关节区放射，剂量分别为10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy，于放疗后1，3，6月每组各处死3只，完整切取颞下颌关节，H-E染色后光镜下观察兔髁状突组织学改变。结果放疗后髁状突软骨纤维层疏松、玻璃样变性，纤维间的间隙增宽，增殖层细胞变形、排列紊乱，肥大层、增殖层和钙化软骨层均有不同程度的变薄，层次不明显，细胞数量减少；放疗后关节结构的组织学改变的严重程度随着放疗剂量的增大及放疗后时间的延长而越趋严重，F组的关节结构破坏最为严重，且6月组较1，3月组严重。结论放疗在早期导致颞下颌关节在组织学上出现一系列退行性变，且这种改变随着放疗剂量和放疗后时间的延长而加重，但期间并未出现关节强直的组织学改变。

关键词:放射疗法； 放射治疗剂量； 下颌骨髁状突； 组织学； 组织学，比较； 兔

作者单位: 福建医科大学 附属第一医院口腔颌面外科，福州350005

在头颈部恶性肿瘤的治疗中，尽管目前的手术及修复水平有了一定提高，但仍有一半以上的患者需要辅助放疗或放化疗，以提高治疗效果[1]。放射治疗在减少局部复发、控制远处转移和提高患者生存率方面发挥了重要作用。但放射线在杀死肿瘤细胞的同时，对机体的正常组织也会造成一定程度的损害，并导致一系列并发症状的出现，进而影响患者的生活质量[2]。已有文献报道，放疗引起的张口困难可能是由于高剂量照射后咀嚼肌群的破坏和纤维化，继而出现关节外强直[3]。但对于颞下颌关节的组织结构在放疗后会出现什么样的变化，是否也会导致关节强直的出现，目前尚不得而知。因此有必要对放疗后颞下颌关节组织结构的变化做进一步的研究。

1材料与方法

1.1动物新西兰兔63只，雌雄不限，3月龄，体质量2.0~2.5 kg[上海生旺实验动物养殖有限公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0007]，喂养于福建医科大学实验动物中心，用标准兔复合饲料喂养。所有动物单笼喂养1周，观察无牙齿缺失、无全身疾患后纳入本实验。实验过程均按照IACUC的要求照顾和处理动物，并经动物伦理委员会同意。

1.2仪器与试剂戊巴比妥钠(德国分装)，进口脱钙液(Rapid Cal.ImmunoTM，福州迈新生物技术开发有限公司分装)，10%甲醛溶液。光学显微镜(日本Olympus公司)；组织切片机(英国Therm Shandon公司)；生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；瓦里安Clinac 600C/D直线加速器(美国通用公司)。

1.3方法

1.3.1实验分组将63只新西兰兔随机分为未放疗组和放疗组，未放疗组9只作为空白对照组，不做任何处理，并于1，3，6月各处死3只，用于收集正常髁状突的组织学资料。放疗组随机分为A~F 6个不同剂量组，放疗总剂量分别为10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy，建立颞下颌关节放射治疗动物模型。

1.3.2兔放疗动物模型的建立将新西兰兔固定于自制木箱，于体表定位颞下颌关节部位，画出定位标志线，前界为眼外眦，后界为外耳道前缘，内界至髁状突内侧1 cm。定位后用直线加速器照射，能量为6 mV，输出量为108 rad/min，源皮距100 cm，照射野大小为2 cm×3 cm，以左侧颞下颌关节作为照射侧。放疗组均接受照射，每次剂量5.4 Gy，隔天1次。

1.3.3组织学观察A~F组兔子建立放疗动物模型后，于放疗后1，3，6月各处死3只。采用耳缘静脉注射空气将动物处死，双侧耳前区备皮，消毒，采用耳屏前切口，逐层切开皮肤、皮下组织，剥离关节浅层软组织，显露颞下颌关节，在其外1.0 cm处切断软组织及骨组织，切取完整双侧颞下颌关节。将标本取材固定、脱钙、脱水、H-E染色后，观察髁状突的组织学结构改变。

2结果

2.1正常髁状突的组织学表现正常髁状突表面为纤维软骨，由浅入深为纤维层、增殖层、肥大层、钙化软骨层和软骨下骨组织。纤维层胶原纤维排列方向大致与髁状突表面平行，其中偶见细胞成分；增殖层有大量密集排列的细胞，细胞较小且胞质少，细胞核深染；肥大层细胞较为肥大，排列成串珠状，与关节表面垂直，由深层向浅层体积逐渐变小；钙化软骨层软骨细胞逐渐移行钙化为骨小梁(图1A)。

2.2放疗后髁状突的组织学变化(1)放疗后1月：A~C组双侧髁状突在组织学上和空白对照组均无明显差异。D组放疗侧髁状突软骨的可见纤维层排列疏松，增殖层和肥大层变化不明显；钙化软骨层、软骨下骨与对照组比较变化不明显。E~F组放疗侧髁状突纤维层明显疏松，纤维间的间隙增宽，髁状突软骨各层次尚清晰，但细胞数量略有减少(图1B)。(2)放疗后3月：A～B组髁状突软骨的变化与对照组比较并不明显，偶见排列疏松的纤维，细胞形态及数目都未见明显变化；C组纤维层疏松，增厚，局部有裂隙，增殖层和肥大层细胞变化不明显，层次清晰；D～E组的髁状突软骨的组织学变化相似，纤维层疏松，纤维间的间隙增宽，表面不光滑，肥大层、增殖层细胞数量略有减少；F组髁状突软骨表层的纤维层排列更为疏松，局部可见纤维层剥脱，增殖层、肥大层和钙化软骨层均有不同程度的变薄，细胞数量减少，软骨下骨结构正常(图1C)。(3)放疗后6月：A～B组纤维层偶见疏松，增殖层及肥大细胞层结构层次清晰，软骨下骨骨板增厚，骨小梁增粗；C组纤维层排列稀疏，局部出现剥脱、变薄，细胞数量略有减少；D组纤维层排列稀疏，可见裂隙，细胞数量减少，增殖层及肥大细胞层变薄，层次不明显，细胞排列紊乱，增殖层细胞变形，细胞数量明显减少；E组纤维层排列稀疏，增殖层、肥大层细胞数量明显减少，细胞核变小，软骨各层界限不清，软骨下骨板增厚，局部可见骨小梁与髁状突表面平行，骨髓腔内可见炎性细胞浸润(图1D)；F组纤维层剥脱消失，表面不光滑，增殖层、肥大层细胞数量减少，骨小梁稀疏，排列紊乱(图1E)。

A：正常髁状突，☆纤维层、△增殖层、○肥大层；B：放疗后1月，F组纤维间隙增宽；C：放疗后3月，F组髁状突软骨变薄，细胞数量减少；D：放疗后6月，E组各层细胞减少，骨板增厚；E：放疗后6月，F组软骨变薄，层次不清，细胞减少.图1　髁状突的组织学观察(H-E染色　×100)Fig 1　Histological observation of condyle(H-E　×100)

3讨论

3.1照射方法选择为了实验操作简便且可模拟临床放射治疗，本实验采用低分割多次照射[4]，每次剂量5.4 Gy，隔天照射1次，根据生物等效剂量LQ公式[5]：BED=nd[1+d/(α/β)](n为照射次数，d为分次剂量，α/β值在颞下颌关节中近似3)，进行等剂量效应转换，可计算出A~F组的放疗剂量为10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy,分别相当于临床常规分割照射剂量的20，30，40，50，60，70 Gy。此剂量范围基本可以覆盖临床上常规二维放疗及调强放射治疗中颞下颌关节的照射剂量。

3.2剂量、时间与损伤程度的关系动物颞下颌关节的退行性变包括：髁状突软骨层变薄，细胞排列疏松，数量减少，表面前软骨细胞增殖抑制，软骨再生能力下降；髁状突表层钙化软骨带消失，关节负重能力下降[6]。本研究采用梯度剂量照射，放疗后1月，A~C 3个剂量组放疗侧的髁状突未见明显异常变化；当剂量达到D组27.0 Gy的时候，开始出现髁状突软骨的纤维层排列疏松，而增殖层和肥大层变化不明显；随着剂量的增加，E~F组的变化较D组更为明显，髁状突各层次细胞数量开始有所减少。放疗后3月，C组开始发生病理变化，D~F组的髁状突组织学变化较放疗后1月更为明显，且随着时间及剂量的增大而加重，E~F组的细胞数量明显减少。放疗后6月，A~B组的髁状突纤维层偶见疏松，增殖层及肥大细胞层结构层次清晰，软骨下骨骨板增厚，骨小梁增粗；C~F组随着剂量的增加，髁状突的组织学改变越明显，其严重程度也比放疗后3月时加重。

在放疗后6月内，A组的剂量并未对髁状突产生明显的影响，在短期内是相对安全的剂量，此剂量相当于临床上常规分割照射的20 Gy。放疗后1月，剂量为27.0 Gy的D组髁状突开始出现一定程度的病理改变，C组到放疗后3月也开始出现髁状突的病理损害。在本研究中，放疗后6月内，剂量达到C组的21.6 Gy时，髁状突便开始出现比较明显的组织病理改变，通过短期的研究观察，可以将21.6 Gy视为髁状突早期损伤的阈值，随着剂量的增大，其出现损伤的程度逐渐加重。根据生物等效剂量转换，本实验中剂量21.6 Gy相当于临床上常规分割照射的40 Gy，这也提示在临床放疗过程中，当颞下颌关节照射剂量达40 Gy时，可能会导致颞下颌关节发生早期的放射性损伤。

3.3颞下颌关节与下颌骨放射性损伤的差异由于颌骨放射性骨坏死临床上更为常见，研究者们更多的把焦点放在颌骨放射性骨坏死的研究上。然而，颌骨放射性骨坏死的机制目前尚不明确，有“放射线、创伤、感染”三因素理论，有目前被广泛接受的“三低”理论(低氧、低细胞、低血运)[7-8]；近年来，有学者提出了放射性纤维萎缩机制[9]；也有研究认为，是放射线对成骨和破骨细胞的直接损伤所致[10]。目前一些学者在下颌骨放射性骨坏死的动物模型研究中发现，下颌骨的组织病理学改变主要表现为骨陷窝空虚，细胞减少，骨髓腔纤维化以及死骨形成等。然而，在本实验对髁状突放射性损伤的研究中，髁状突软骨主要表现为纤维结构破坏，层次不明显，细胞减少且排列紊乱等。软骨下骨组织则主要表现为骨小梁稀疏、排列紊乱，骨髓腔内炎症细胞浸润。髁状突骨组织出现组织学上改变的时间较髁状突软骨明显延迟，6个梯度剂量组中软骨下骨组织直到放射后6月才开始出现组织学变化，其结构变化以高剂量组最为明显。对于放射后髁状突与下颌骨出现的不同表现，分析其原因可能是由于髁状突软骨是一种纤维软骨，其内不含血管，其营养与关节的运动和滑膜分泌的滑液有关，加上关节软骨本身存在改建与修复能力，这显然不同于血运丰富的颌骨。因此放射线对髁状突造成的破坏较下颌骨轻微许多，其放射性损失的机制亦有别于颌骨放射性骨坏死的“三低”理论，值得进一步深入研究。

综上所述，放疗后髁状突的组织学变化均表现为组织结构的退行性变，与其他大量关于颞下颌关节紊乱病的动物实验研究中颞下颌关节出现的退行性变结果相似，说明放疗后短期内尚未出现张口困难等严重并发症之前，将首先出现颞下颌关节紊乱病的表现，并且放疗后髁状突所出现病理变化的程度将随着放疗剂量及放疗后时间的延长而加重。目前，对于放疗引起颞下颌关节的损伤，临床上关注更多的是患者是否出现张口困难。对于放疗后早期，尚未出现张口困难之前，颞下颌关节紊乱病的发生发展并未引起人们足够的重视。本研究发现，放疗可能也是导致患者颞下颌关节紊乱的一个重要因素。因此，临床上有必要在放疗后早期就对颞下颌关节进行定期检查评估，这将有利于颞下颌关节紊乱病的早诊断、早治疗，并可以在一定程度上预防颞下颌关节放射性损伤的加重。此外，放疗后颞下颌关节的损伤主要表现为组织结构的退行性变，对于放疗后出现的张口受限，可能多为关节外肌群及软组织的纤维化所致，因此在手术治疗此类患者时，应重点考虑关节外软组织的处理。

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(编辑：何佳凤)

A Study on the Impact of the Histological Structure

of Rabbit Condyle after Gradient Doses Irradiation

LIAO Yunyang, ZHANG Weijian, CHEN Fangchuan, QIU Yu, LIN Lisong

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the histological change of the rabbit condlye after gradient doses irradiation.Methods63 New Zealand rabbits were assigned to radiotherapy group and untreated group.We employed the untreated group as blank control which normal TMJ data was collected and no intervention given.The animal subjects in irradiation were further randomly assigned to 6 groups with gradient doses irradiation.The doses for 6 groups were 10.8, 16.2, 21.6, 27.0, 32.4 and 37.8 Gy.The execution for 3 animal subjects in every group with irradiation was performed after 1, 3 and 6 month after initial exposure and histopathological technique were applied.ResultsThe histological result of animal subjects with irradiation indicated that the osteoporosis and hyaline degeneration in condylar cartilage, boarded interval between fibers, deformability and disarrangement of proliferative cells, various instensity of thinning in proliferative zone, hypertrophic zone and calcified cartilage zone, and reduction in cell counts.The histological change of joint with irradiation was positively associated with the dose and time of irradiation.The destruction of joint in F group can be qualified as the most severe among all irradiation groups and 6 months group was more severe than 1 month and 3 months groups.ConclusionsThe radiotherapy is capable of inducing the degeneration in the early stage, and the change is positively related with the dose and duration after radiotherapy.However, there was no histological changes of ankylosis during the experimental period.

KEY WORDS:radiotherapy; radiotherapy dosage; mandibular condyle; histology; histology, comparative; rabbits

通讯作者:林李嵩. Email: dr_lls@163.com

作者简介:廖云阳(1984-)，男，住院医师，医学硕士

收稿日期:2015-08-25

中图分类号:R-332； R322.41； R782.6； R815； R815.2

文献标志码:A

文章编号:1672-4194(2015)05-0298-04