混菌发酵对加减四君子汤营养成分变化及多糖提取的影响

2015-03-11靳双星张桂枝雷兰霞

中国兽医杂志 2015年7期

靳双星，张桂枝，雷兰霞

（1.河南牧业经济学院畜牧工程系，河南郑州450046 ；2.河南浚县职业中等专业学校，河南鹤壁456250）

发酵是中药炮制的一种重要手段和方法。微生物可利用中药成分作为营养物质进行生长、繁殖和代谢，在此过程中分泌的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等胞外酶，使植物细胞壁破裂，从而利于中药有效成分从胞内释放，最大限度地得以提取和利用[1]。多位研究者[2-4]对中药生物发酵进行了研究，取得了一定的进展。但多针对单一菌种与单一中药的发酵研究，缺乏复方中药制剂与复合菌种联合发酵的研究，因此，本试验利用多种菌种混合固态发酵加减四君子汤，考察其对加减四君子汤成分变化及多糖提取的影响，对复方中药发酵制剂质量评价有一定的参考意义，为该制剂工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产朊假丝酵母（Candida utilis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 加减四君子汤由连翘、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、枳实、山楂、甘草等8 味中药组成。购自郑州九九重阳大药房。分别于50 ℃～60 ℃下烘干2～3 h，粉碎，100%过80 目筛，备用。

1.3 培养基种子培养基：枯草芽孢杆菌采用营养肉汤培养基，在37 ℃、200 r/min 条件下培养16～17 h 后,调整活菌数达到1×109CFU/mL；产朊假丝酵母采用YPD 培养基，在28 ℃、200 r/min 条件下培养20～24 h 后，调整活菌数达到1×109CFU/mL。嗜酸乳杆菌采用MRS 培养基，在37 ℃、200 r/min 条件下培养16～17 h 后，调整活菌数达到1×109CFU/mL。

1.4 固态培养基以加减四君子汤为主要发酵原料，含麸皮3.0%、葡萄糖2.5%、硫酸铵1.5%、磷酸二氢钾0.15%、磷酸氢二钾0.5%、MgS04.7H2O O.5%。此培养基在121 ℃下灭菌20 min，备用。1.5 加减四君子汤发酵制剂的制备加减四君子汤发酵前调整物料含水量为50%，pH 值为6.0左右，使枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌=1∶1∶1，混匀后，按4%接种量接入物料中，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于31 ℃的环境中培养72 h，烘干，备用。

1.6 发酵前后加减四君子汤成分测定方法为减少误差，对发酵前加减四君子汤成分测定时，也要以同样条件制备固体培养基、调整物料含水量、pH 值以及混菌接种，不经发酵，烘干，备用，暂称为发酵前混菌加减四君子汤。粗蛋白测定采用凯氏定氮法；粗脂肪测定采用索氏提取法；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素测定采用Van Soest 法测定。

1.7 多糖的提取称取发酵前混菌加减四君子汤和加减四君子汤发酵制剂各100 g，加蒸馏水1 000 mL，在80 ℃水浴浸提2 h，提取3 次，合并水提液，离心，上清液浓缩至100 mL，加95%乙醇至含醇量为80%，静置12 h，减压抽滤，上清液加95%乙醇至含醇量为80%，静置12 h，减压抽滤，分离出沉淀用无水乙醇洗涤多次，低温干燥，即得相应多糖粗提物。重复3 次，计算得率。

1.8 多糖的含量测定参照文献[5]介绍的蒽酮-浓硫酸法测定多糖含量。

1.9 数据处理试验数据使用Excel 2007 和SPSS 12.0 统计软件进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵前后加减四君子汤营养成分变化

从表1 的试验结果可以看出，加减四君子汤经混菌发酵后，粗蛋白由发酵前的10.75%提高到15.16%，提高了41.02%，与发酵前相比具有显著差异（P＜0.05）；粗脂肪由发酵前的2.37%提高到3.63%，提高了53.16%，与发酵前相比具有显著差异（P＜0.05）；中性洗涤纤维由发酵前的46.72%降低到33.68%，降低了27.91%，与发酵前相比具有显著差异（P＜0.05）；酸性洗涤纤维、木质素分别降解了21.46%、12.27%，但与发酵前相比差异不显著（P＞0.05）。发酵后粗蛋白、粗脂肪含量明显升高，而中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和木质素都有不同层度降解，说明加减四君子汤混菌发酵前后营养价值有了明显的提高。

2.2 混菌发酵前后加减四君子汤多糖得率和含量变化由表2 试验结果可知，加减四君子汤经混菌发酵后，多糖得率由发酵前的15.41%提高到21.84%，提高了41.73%，与发酵前相比具有极显著差异（P＜0.01）；多糖含量由发酵前的45.66%提高到56.75%，提高了24.29%，与发酵前相比具有极显著差异（P＜0.01）。

表2 混菌发酵前后加减四君子汤多糖得率和含量变化（%，n=3）

3 讨论

目前使用的中药多为植物体或植物的部分组织，其有效成分多存在于植物细胞内，然而植物细胞有细胞壁保护，细胞壁又是由纤维素、半纤维素、木质素等组成，因其结构致密，胞内大分子活性物质难以穿过细胞壁，导致中药的有效成分利用率较低[6-7]。为提高复方中药制剂的利用效率，本研究利用优选的多菌种发酵工艺，对加减四君子汤进行混菌发酵处理，发酵后，其营养价值有了明显的提高，粗多糖的得率和含量有明显的提升。这可能是由于以下几个方面的原因：微生物利用中药成分作为营养基质进行生长、繁殖和代谢，产生了大量的菌体蛋白、脂类或胞外多糖；在发酵过程中细菌分泌了大量的纤维素酶、半纤维素酶等胞外酶，使植物细胞壁破裂，从而利于中药有效成分从胞内释放，最大限度地得以提取和利用；也有可能在混菌发酵过程中，产生的大量有机酸，细胞壁纤维起到软化或分解作用，导致大量加减四君子汤中的多糖从细胞中游离出，从而提高了粗多糖的得率和含量。