益生菌联合新城疫疫苗应用雏鸡消化道局部黏膜组织C D 4+C D 8+T 细胞数量变化

吕晓萍，高雪丽，刘超男，申海龙，郑世民

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030 ；2.浙江省长兴县农业局，浙江 长兴313100）

益生菌是指通过摄入适量从而对宿主产生有益作用的活菌。其是机体肠道共生菌群的重要组成部分，形成并维持肠道菌群的动态平衡[1-2]，可提高机体细胞免疫和体液免疫，增强机体抵抗力[3]。随着养殖业的大规模发展，因饲养者滥用抗生素，导致动物产生耐药性而无法控制某些疾病的发展和蔓延。为改变这一现状，人们着力寻找能替代抗生素的天然添加剂。目前研究和使

用最多的是各种益生菌，其天然，无毒副作用，无残留，不污染环境，还可提高动物抗应激能力和机体的免疫功能[4]。本文旨在通过对雏鸡消化道局部黏膜免疫组织CD4+、CD8+T 细胞亚型数量动态变化的研究，从亚细胞水平上检测局部黏膜组织细胞免疫功能变化，揭示雏鸡饲喂益生菌、益生菌与ND 疫苗联合应用后，雏鸡局部黏膜组织细胞免疫变化规律，为益生菌在动物界的研发和应用提供科学试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1 日龄艾维因混合肉雏鸡100 只，购自哈尔滨某孵化场。经鸡传染性囊病、鸡马立克病和鸡传染性支气管炎等抗体检测均为阴性。

1.2 试验主要试剂 产酶益生菌，购自山东华尔康生物技术有限公司；新城疫疫苗，购自哈药集团生物疫苗有限公司；鼠抗鸡CD4（CD8）单克隆抗体（代号8210-01 和8220-01），购自Southern Biotech 公司。

1.3 试验动物分组及处理 100 只雏鸡随机分为益生菌组（简称P 组）、ND 疫苗组（简称V 组）、益生菌联合ND 疫苗免疫组（简称P+V 组）和对照组（简称C 组）4 组，每组25 只雏鸡，分别做如下处理：

P 组：雏鸡分别于1 日龄和18 日龄连续灌服益生菌稀释液3 d，1 次/天；V 组：雏鸡分别于1 日龄和18 日龄连续灌服生理盐水3 d，1 次/天，并分别于在10 日龄和21 日龄经点眼、滴鼻接种新城疫弱毒苗，其中21日龄疫苗免疫剂量为10日龄的2倍；P+V组：雏鸡除将V 组的灌服生理盐水改为灌服益生菌外，其他处理与V组相同；C组：雏鸡分别于1 日龄和18日龄连续灌服生理盐水3 d，1 次/d，为对照。

1.4 试验材料采取及处理 C、P、V、P+V 组雏鸡分别于首次疫苗免疫后第0、7、14、28 天和第42天，每组随机抽取5 只雏鸡，心脏采血处死，快速采取盲肠扁桃体、十二指肠和回肠派伊尔结固定于4 ℃预冷的10%中性福尔马林缓冲液中，于冰箱4 ℃固定24 h。

1.5 CD4+、CD8+T 细胞数量检测及方法-组织石蜡切片及免疫酶组织化学染色法（SP法）（1）前期处理：包括取材、充分固定24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，58 ℃浸蜡2 h，石蜡包埋后，常规切片（4 μm）、烤片，切片脱蜡，梯度酒精水化；（2）3%H2O2室温阻断15 min，PBS 洗；（3）0.1%胰蛋白酶消化10 min，PBS洗；（4）微波修复抗原：中火5 min，停5 min，解冻档2 min，凉至室温后取出切片；（5）山羊血清封闭室温20 min，PBS 洗；（6）加入一抗：分别滴加1∶200 稀释的MAC-CD4或MAC-CD8单克隆抗体，于湿盒内4 ℃过夜，PBS 洗；（7）加入二抗：滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育15 min，PBS 洗；（8）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min，PBS 洗；（9）DAB 避光显色，室温5 min，PBS 洗；（10）苏木素复染，梯度酒精脱水，透明，中性树胶封片。每次染色均设一抗和二抗阴性对照片。

结果检验：参考Romppanen 格点计数法[5]（point counting method），油镜检查免疫组织特定区域，以103x细胞/cm2表示。阳性判定：特定区域出现棕黄色颗粒为阳性反应。阳性分3 个等级，弱阳性呈淡棕黄色，颗粒细；强阳性呈深棕黄色，颗粒粗；中度阳性介于二者之间。注意区分非特异性染色，如组织边缘、刀痕处或某局部的均匀着色。

1.6 数据处理 采用SPSS13.0 软件进行数据处理，数据以平均值±标准误（“-X ±S”）表示。

2 结果

2.1 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡盲肠扁桃体CD4+、CD8+T 细胞数量变化

2.1.1 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡盲肠扁桃体CD4+T 细胞数量变化 雏鸡接种ND 疫苗后42 d内，益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡、ND 疫苗单独免疫雏鸡，其盲肠扁桃体弥散区和淋巴小结的CD4+T 细胞数量均不同程度高于益生菌雏鸡和对照雏鸡，于疫苗免疫后7～28 d 差异明显（P＜0.05或P＜0.01）；益生菌雏鸡高于对照雏鸡（表1）。

表1 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡盲肠扁桃体C D 4+T 细胞数量变化

2.1.2 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡盲肠扁桃体CD8+T 细胞数量变化 雏鸡接种ND 疫苗后7～42 d，益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡、ND疫苗单独免疫雏鸡，其盲肠扁桃体弥散区和淋巴小结的CD8+T 细胞数量均不同程度地低于未接种疫苗的益生菌雏鸡和对照雏鸡，其分别于7～14 d 和7～28 d 差异显著（P＜0.05 或P＜0.01）（表2）。

表2 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡盲肠扁桃体C D 8+T 细胞数量变化

2.2 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡肠派伊尔结CD4+、CD8+T 细胞数量变化

2.2.1 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡肠派伊尔结CD4+T 细胞数量变化 雏鸡接种ND 疫苗后42 d内，益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡、ND 疫苗单独免疫雏鸡，其十二指肠和回肠派伊尔结CD4+T 细胞数量均不同程度高于益生菌雏鸡和对照雏鸡，于疫苗免疫后7～14 d 差异明显（P＜0.05 或P＜0.01）；益生菌雏鸡高于对照雏鸡（表3）。

表3 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡肠派伊尔结C D 4+T 细胞数量变化

2.2.2 益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡肠派伊尔结CD8+T 细胞数量变化 雏鸡接种ND 疫苗后7～42 d，益生菌联合ND疫苗免疫雏鸡、ND疫苗单独免疫雏鸡，其十二指肠和回肠派伊尔结CD8+T 细胞数量于7～28 d明显低于益生菌雏鸡和对照雏鸡，（P＜0.05或P＜0.01）（表4）。

表4 益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡肠派伊尔结C D 8+T 细胞数量变化

3 讨论

本研究发现，雏鸡接种ND疫苗后7～42 d，益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡、ND 疫苗单独免疫雏鸡，其盲肠扁桃体和十二指肠及回肠派伊尔结CD4+T 细胞数量均不同程度高于益生菌雏鸡和对照雏鸡；于免疫后7～14 d 差异明显（P＜0.05 或P＜0.01）。表明益生菌联合新城疫疫苗应用，提高了雏鸡消化道局部黏膜组织的细胞免疫水平。产生上述变化的可能原因是：疫苗作为抗原进入机体后，首先被以巨噬细胞为主的抗原提呈细胞捕获，一方面对其加工处理，浓集抗原决定簇于细胞表面；另一方面分泌细胞因子IL-1，在MHCII 类分子作用下，辅助性Th细胞（CD4+T 细胞亚群）识别并接受相应抗原决定簇和IL-1刺激，活化淋巴母细胞。致敏的Th 细胞表面表达IL-2 受体，同时释放多种细胞因子，如IFN-γ、IL-6 等，参与细胞免疫。

本试验还发现，ND 疫苗免疫雏鸡后7～42 d，益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡的局部黏膜免疫组织CD4+T 细胞数量均不同程度高于ND 疫苗单独免疫雏鸡，表明益生菌与ND 疫苗联合使用，增强了雏鸡局部黏膜的细胞免疫功能。雏鸡接种ND疫苗后7～42 d，益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡，其盲肠扁桃体和十二指肠及回肠派伊尔结CD8+T细胞数量明显低于未接种疫苗的益生菌雏鸡和对照雏鸡。其中，盲肠扁桃体弥散区和回肠派伊尔结的CD8+T 细胞数量在7～14 d 差异明显（P＜0.05 或P＜0.01）；盲肠扁桃体淋巴小结区和十二指肠派伊尔结在7～28 d 差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）；益生菌联合ND 疫苗免疫雏鸡和ND疫苗单独免疫雏鸡局部黏膜免疫组织的CD8+T 细胞数量在ND 疫苗免疫后28～42 d 与益生菌雏鸡和对照雏鸡基本趋于一致。产生上述变化的可能原因是：在ND 疫苗刺激机体初期和中期，CD4+T、CD8+T 细胞的变化特点，是有利于B 细胞激活、抗体产生和细胞因子的释放。疫苗接种后，如果疫苗组分中的抗原通过B 细胞表面受体识别并摄取至胞内，加工后由MHCII 类分子呈递给CD4+T细胞，使其活化并分泌IL-2、IL-4 和IL-5 等细胞因子，这些细胞因子与B 细胞表面相应受体结合，促进B 细胞增殖、分化，产生针对相应抗原的抗体。如果B 细胞受到ND 弱毒感染，则内源性抗原由MHC I 类分子呈递给CD8+T 细胞，并诱导CTL前体细胞分化为效应CTL，杀伤感染的B 细胞。本试验中CD8+T 细胞数量减少，表明试验中大部分疫苗抗原被捕获后，主要呈递给辅助性CD4+T细胞，进而辅助B 细胞产生抗体。CD8+T 细胞数量减少抑制了自身杀伤作用的发挥，从另一角度讲，也间接协助抗体产生。本试验中疫苗接种是通过滴鼻、点眼途径，更有利于直接刺激黏膜免疫系统，CD4+T、CD8+T 细胞数量的变化不但反映其功能，也反映了机体的免疫状态。益生菌可以进行免疫调节，主要与机体特异性微生物或与肠上皮细胞的相互作用有关[6]。靳二辉等发现[7]，添加芽孢杆菌类益生素可明显增加21 日龄和42 日龄肉鸡的免疫器官指数，表明芽孢杆菌类益生素对肉鸡免疫器官发育有明显促进作用。温建新等[8]研究发现，乳酸L-68 型粪肠球菌对艾维因肉鸡的免疫器官发育有促进作用，能提高免疫器官指数，提高机体抗病能力。进一步表明益生菌和ND 疫苗的联合应用，提高了机体对ND 疫苗的免疫应答和黏膜细胞免疫水平。

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[8] 温建新，王华友，李焕明.乳酸L-68 型粪肠球菌对肉鸡免疫功能的影响[J].山东畜牧兽医.2008，29（6）：4-6.