两株不同毒力单增李斯特菌致病性试验

李晓云，李 巍，伊娜娜，张子群，刘 兵，初纯明，宋铭忻

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030 ；2.黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨150001）

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要的人兽共患食源性病原菌，包括人类在内的40 多种哺乳动物、20 多种飞禽类和部分水生动物均可分离到该菌，可引起人和动物的脑膜炎、胃肠炎、慢性肝炎、败血症及死胎、流产等，也有研究表明，感染该菌偶尔可引起皮肤组织的损伤和流行性感冒样症状[1-2]。人类感染率虽然不高，但是感染后很容易发病，平均致死率达20%～30%[3]，在免疫功能缺陷者以及新生儿、孕妇、老年人等免疫力低下人群中更高达70%[4]。不同来源的菌株致病性差异较大，有些菌株致病性很强，而另一些菌株毒力较弱甚至无致病性[5]。为研究不同毒力单增李斯特菌对机体的致病性差异以及机体对不同毒力菌株的免疫应答差异，选取毒力差异显著的两株LM（菌株LMo 0586 和LM N21），通过建立不同毒力及菌量的小鼠感染模型（A 组：低剂量攻弱毒、B 组：半数致死量攻弱毒、C 组：半数致死量攻强毒、D 组：过量攻强毒），观察LM 在小鼠体内的动态分布情况、小鼠机体组织病理学变化并对血清中重要炎性因子IL-12、TNF-α、INF-γ进行动态观察，为研究单增李斯特菌致病机制及开发新型疫苗载体等工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与实验动物 菌株LM N21 为本实验室保存，菌株LMo 0586 为东北农业大学微生物实验室李一经教授惠赠。本实验室已完成两株菌的半数致死量（LD50）测定，LMo 0586 的LD50为105.5、LM N21 的LD50为108.2，两菌株毒力差异显著，LM N21为弱毒株，LMo 0586 为强毒株。实验动物为5 周龄雌性清洁级昆明系小鼠（体重20 g 左右），购自哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心。

1.2 培养基及主要试剂 李斯特菌培养基TSBY 和增菌液按照《GB 4789.30-2010 食品微生物学检验方法》配制。rTaq 聚合酶、dNTP Mixture、酵母提取物、胰蛋白胨，均购自大连宝生物工程有限公司；细胞因子ELISA 试剂盒，购自RD 公司。

1.3 小鼠感染及分组 两株不同毒力李斯特菌分别培养，收集菌体并计数，根据菌株的半数致死量（LD50），用PBS 缓冲液调整菌体浓度为105.5CFU/mL和108.2CFU/mL，将小鼠分成4 组（A 组～D 组，40 只/组）进行腹腔注射，每鼠注射0.2 mL 菌液。A组：105.5CFU/mL 的弱毒株LM N21；B 组：108.2CFU/mL 的弱毒株LM N21；C 组：105.5CFU/mL 的强毒株LMo 0586；D组：108.2CFU/mL 的强毒株LMo 0586。同时设对照组若干，腹腔注射生理盐水，对照组和试验组的全部小鼠在相同条件下喂饲。

1.4 LM 在感染鼠体内的动态分布检测 细菌感染后，于2、4、6、8、12 h、1 d、2 d，从各组中随机取出3只小鼠，断颈处死，无菌条件下剖取心脏、脑，分别匀浆，将匀浆液抽至EB 增菌液中，37 ℃培养48 h。对培养物进行PCR 检测，引物参照Deneer 等设计的特异性引物[6]（主要扩增保守的hlyA 基因片段），扩增片段长度为743 bp，PCR 产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现743 bp 特异性条带为阳性。

1.5 LM 感染鼠肝脏及脑组织病理学观察 取感染后12 h、1 d 的小鼠肝组织以及感染1 d 的脑组织制作石蜡切片，以常规方法进行H.E.染色，观察小鼠肝脏及脑组织的病理学变化。

1.6 小鼠血清重要炎性因子动态变化检测 于4、8、12 h、1、2、3、5 d 和7 d，从各组中随机取出3只小鼠，眼球采血，5 000 r/min 离心取血清，使用ELISA 试剂盒检测各组血清中IL-12、TNF-α、INF-γ细胞因子的表达量，按照试剂盒使用说明书进行操作，用酶标仪测定吸光度（OD）值，通过标准曲线计算样品中各因子含量。

2 结果

2.1 单增李斯特菌在感染鼠心脏和脑中的动态分布 4 组小鼠均于不同时期在心脏、脑中检出LM，结果见表1。感染后2 h，C、D 两组小鼠心脏中就可检出LM，感染后4 h，这两组全部小鼠心脏均检出细菌，此时A、B 两组还各有1 只小鼠未检出细菌。感染后6 h，D 组的1 只小鼠脑中检出LM，至感染后8 h，C、D 两组各有两只小鼠在脑中检出细菌，此时A、B 两组各有1 只小鼠脑中检出细菌，至感染后2 d仅有1 只小鼠（A 组）未在脑中检出细菌。

2.2 感染LM 小鼠状态及剖检、组织病理变化 感染后4 组小鼠均出现了不同程度的病态变化：A 组小鼠感染后1 d，部分小鼠出现精神委靡、食欲减少、皮毛无光泽等症状，感染后2 d 表现出症状的小鼠数量增多，5 d 后，症状逐渐减轻至恢复健康状态，试验期间内无小鼠死亡。在2 h～6 h 内，各脏器无明显病理变化，8 h 剖检的3 只小鼠中有1 只小鼠脾脏稍有水肿，12 h 剖检的小鼠可见肝脏肿大的病理变化，试验期间小鼠脑部未见明显的病理变化。B组小鼠感染后1 d，大部分小鼠除了出现与A组相似的患病症状外，还出现了抽搐、点头、绕圈等神经症状，5 d 后症状缓解，感染后2 d 开始有小鼠陆续死亡，至试验结束除正常处死的小鼠外共死亡5 只。6 h 出现脾脏肿大，8 h 有2 只小鼠出现肝脏肿大的症状，2 d 时1 只小鼠脑组织出现水肿、出血。C 组小鼠与B组小鼠症状类似，感染1 d有1只老鼠死亡，至试验结束除正常处死的小鼠外共死亡7 只。1 d时即有小鼠脑组织出现病理变化。D组小鼠感染后12 h，就有部分小鼠出现了患病症状，感染后1 d，小鼠开始陆续死亡，到第5 天，包括正常处死在内的40只小鼠全部死亡。

显著组织病理变化如图1。感染后12 h，A 组小鼠肝细胞无明显病理变化，B、C、D 组小鼠可见不同程度的肝细胞损伤，部分静脉细胞脱落进入管腔；感染后1 d，A 组小鼠肝细胞也出现轻微病变，其他3 组肝实质出现坏死，肝细胞溶解，肝静脉扩张并严重充血。A 组小鼠脑组织无明显病理变化，其余3 组有不同程度的病变，可见脑实质部分出现坏死灶，有微血栓形成。

2.3 感染小鼠血清中重要炎性因子含量变化试验结果如图2 所示。小鼠血清中IL-12 仅在LM感染早期有较高的表达量，除D 组在4 h 达到峰值外，其他3 组均在8 h 达到峰值，感染后期4 组小鼠血清中IL-12 的含量与正常组无显著差异（P＞0.05），单因素方差分析组间差异不显著（P＞0.05）。小鼠血清中TNF-α在LM 感染早期有较高的表达量，4 组均在8 h 达到峰值，感染后期4 组小鼠血清中TNF-α的含量也略高于正常组，单因素方差分析组间差异不显著（P＞0.05）。小鼠血清中INF-γ在LM 感染早期有较高的表达量，4 组均在8 h 达到峰值，在感染后期，除A 组仅略高于正常组外，其他3 组均有较高的表达量（P＜0.05），单因素方差分析组间差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

本试验通过腹腔注射小鼠的方法研究不同毒力及浓度单增李斯特菌的致病性差异。LM 无论是通过何种方式感染动物机体，都需要经过血液循环侵入机体各组织脏器，因此检测小鼠心脏中细菌动态分布情况对证明小鼠感染模型建立是否成功及探讨细菌迁移能力具有很重要的意义。脑炎是LM 的特征性病理症状，因此研究脑组织中细菌动态分布情况，对判断致病力亦是十分重要的。本试验4 组小鼠在心脏和脑中的动态分布情况不同，其中过量攻强毒株LMo 0586 的小鼠明显比其他3 组的小鼠更早发现细菌，说明毒力强的LM 在小鼠体内有更强的迁移能力，推测可能是过量的细菌使机体免疫系统不能及时清除细菌，从而导致细菌大量增殖所致；同时发现即使相同毒力（同为半数致死量）的强弱毒株在心脏和脑中的动态分布情况也存在差异，其中，1只感染强毒株的小鼠在感染后2 h 就可以在心脏中检出细菌，感染后4 h，强毒株组的3 只受检小鼠都可以在心脏中检出细菌；而感染后2 h，弱毒株组未在心脏中检出细菌，感染后4 h 弱毒株组的3 只受检小鼠中还有1 只小鼠未在心脏中检出细菌，说明两株菌迁移能力和运动性存在差异，推测这两株菌与运动性有关的基因（actA、plcB）发生的点突变可能对细菌毒力变化产生影响[7]。

图1 小鼠肝脏和脑的病理变化，H.E.染色 （×10）

图2 4组感染LM小鼠不同时期血清炎性因子含量变化 （pg/μL）

感染李斯特菌后4 组小鼠均出现了不同程度的病理变化。感染的细菌毒力越强，小鼠出现症状的时间越早，这与感染鼠心脏及脑中细菌动态分布情况相一致，除感染低剂量弱毒的小鼠未出现明显的神经症状外且试验期间未出现死亡，其他3 组小鼠都出现了不同程度的神经症状，感染同等毒力细菌的两组小鼠有相似的症状及病理变化，感染不同剂量的同菌株的几组小鼠间病变程度存在差异，感染同等剂量的几组小鼠间病变程度差异显著。试验中4 组小鼠均出现了不同程度的脾脏和肝脏肿大，通过观察肝脏组织切片，可明显看出有肝细胞破裂、肝静脉充血、脑实质充血、坏死等病理变化。肝脏损伤程度与细菌毒力呈正相关，过量攻强毒的小鼠肝脏损伤严重；低剂量弱毒株小鼠脑组织无严重病理变化，与这组小鼠未出现显著的神经症状相一致，而此组小鼠脑中也检出细菌，推测是由于增菌后进行PCR 检测这一方法敏感度过高，实际穿透血脑屏障的细菌数量极低，不足以引起明显的脑损伤。可见，单增李斯特菌对小鼠的致病力存在显著的剂量及毒力依赖性。

作为一种胞内菌，机体对LM 的免疫反应主要以细胞免疫为主，在感染后机体的整个免疫应答过程中，TNF-α、IL-12 和IFN-γ都在清除LM感染中扮演着重要的角色。本试验通过检测小鼠血清中重要细胞因子的动态变化来研究机体对不同毒力LM的免疫应答差异。总体来看，这3 种细胞因子的表达量都呈现出相似的变化趋势，即在感染早期表达量上升至峰值，随后逐渐下降至平稳；经组间比较可以看出，除高剂量攻强毒的小鼠比其他3 组小鼠更早的引起机体免疫应答反应外，4 组间无显著差异。可以看出，不同毒力的单增李斯特菌可引起机体产生相似的免疫应答。

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