泌乳奶牛铜缺乏与机体氧化应激的关系

许楚楚，刘健男，夏 成，张洪友，徐 闯

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆163319）

微量元素Cu 是维持奶牛机体正常新陈代谢的重要物质，在20 世纪初，Cu 就被认为是动物营养中必须的微量元素。Underwood 等报道，奶牛血浆Cu的正常含量为0.576～0.96 mg/L（9～15 mmol/L），当血浆中Cu 含量低于该值时视为缺乏[1]。

动物机体的抗氧化能力能反映机体对不良环境和疾病的抵抗能力。抗氧化体系中酶促反应体系主要包括一些酶，它们有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，这些酶的活性中心是微量元素。总抗氧化能力（T-AOC）能反映动物体内两套抗氧化体系总能力高低的指标，常常用于临床生化检验[2]。铜蓝蛋白（CP）是一种与免疫系统密切相关的铜蛋白，其作用为调节铜在机体各个部位的分布、合成含铜的酶蛋白，有着抗氧化剂的作用，并具有氧化酶活性，对多酚及多胺类底物有催化其氧化的能力[3]。当前，由于我国奶牛泌乳量的不断提高，铜缺乏的亚临床病例不断增加，增高了机体对疾病的易感性，机体患病的风险明显增大。因此，本试验通过检测泌乳奶牛微量元素Cu 和氧化应激指标的变化，不仅能阐明泌乳奶牛铜缺乏与机体氧化应激的关系，而且能探索铜缺乏的风险预警体系，为今后更有效的预防Cu 缺乏和提高机体抗氧化应激能力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 在黑龙江省某集约化规范化千头牛场，泌乳奶牛采用散栏式饲养，TMR 全混日粮饲喂方式。选取体况相近（2.5～3.5），胎次相近（2～3 胎）的荷斯坦奶牛156 头。试验动物根据血浆Cu 水平，血浆Cu 含量小于9 mmol/L 为Cu 缺乏组，大于9 mmol/L 为Cu 正常牛。根据此标准将奶牛分为Cu 缺乏组26 头，Cu 正常组130 头。

1.2 样品采集和分析 所有的试验奶牛清晨空腹尾静脉采集血样10 mL，加肝素（20 μ/mL）抗凝，（3 500 r/min 离心10 min），分离血浆-80 ℃冻存。利用分光光度法测定血浆Cu 水平，Cu 试剂盒，购自南京建成生物工程公司；采用UNICO7200分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司提供）测定超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和铜蓝蛋白（CP）等，它们的试剂盒，均购自南京建成生物工程公司。

试验数据使用SPSS 19.0 进行统计分析。

2 结果

2.1 试验牛血浆Cu 和氧化应激指标的比较 由表1 可知，Cu 缺乏组的CP 水平显著低于Cu 正常组（P=0.000），Cu 缺乏组的T-AOC 水平显著高于Cu 正常组（P=0.004）。Cu 缺乏组的SOD、GSH-Px水平和正常组无显著差异（P=0.076，P=0.585）。

表1 试验牛血浆C u和氧化应激指标的水平（平均数±SD）

2.2 试验奶牛氧化指标与Cu 的相关性分析 由表2 可知，血浆中CP（R=0.049，P=0.00）与Cu 缺乏呈极显著正相关，T-AOC（R=0.218，P=0.006）与Cu缺乏呈极显著负相关，SOD（R=0.074，P=0.356）与Cu 缺乏无相关性，GSH-Px（R=-0.025，P=0.756）与Cu 缺乏无相关性。

2.3 试验奶牛氧化应激指标对铜缺乏的预警作用 在表3 中列出了泌乳奶牛Cu 缺乏预警相关指标的分界值、敏感度和特异度及其各自的标准误、阳性似然比和曲线下面积。通过计算Youden指数确定的最佳分界值和对应的敏感度和特异度。 由表3 和图1 可知，各项氧化指标中CP 对Cu缺乏的诊断意义较大（AUC=0.709，P=0.001），临界值为13.7U/L。

表2 奶牛抗氧化指标与C u缺乏的相关性

表3 氧化应激指标对C u缺乏诊断R O C 分析

3 讨论

奶牛机体正常情况下，机体的抗氧化能力和源源不断产生的氧自由基的氧化能力之间保持着一个动态的平衡关系，以确保机体组织免于氧化损伤。当抗氧化能力下降或者自由基产生异常增多的时候，将会导致组织的氧化损伤，从而促发许多疾病[4]。为防护氧自由基对生物膜的损伤，动物机体有着一套完善的抗氧化防御系统。按其性质可分为酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统，酶抗氧化系统是有T-AOC、SOD、GSH-Px 等。非酶抗氧化系统中Cu、Mn、Zn、Se 是酶抗氧化指标的活性中心，直接影响这些酶的活性[5]。研究表明，Cu 在抗氧化作用方面，通过不同的方式发挥着重要的作用。当动物缺Cu 时，体内发生的各种病理或者生理变化与过氧化物的作用关系非常密切[6]。

本试验中，T-AOC 与Cu 缺乏呈极显著负相关（R=-0.218，P=0.006）。正常情况下，体内产生超氧阴离子自由基、过氧化氢等强氧化剂被抗氧化酶系及时清除。当Cu 缺乏时，抗氧化酶系活性降低，超氧阴离子自由基和过氧化氢积累，过量的超氧阴离子自由基使NO 氧化生成过氧硝酸盐直接攻击生物膜，发生脂质过氧化，使细胞膜结构和功能发生变化，流动性降低，导致细胞机能降低[7]。过量的过氧化氢使Cu2+形成Cu+O、Cu2+-OH攻击酶临近组氨酸残基，使许多酶失活。过量的超氧阴离子自由基和过氧化氢还可使还原性谷胱甘肽氧化生成氧化型谷胱甘肽，从而反馈性抑制GSH-Px 的活性。当动物缺Cu 时，主要是通过大量活性氧改变免疫活性细胞的表面结构，从而导致组织内SOD 和GSH-Px 活性降低[8]。但本试验中血浆中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏的关系不显著。柴春彦[9]等研究表明，Cu 缺乏临床组SOD 和GSH-Px 的含量和对照组差异明显，但是亚临床组SOD 和GSH-Px 的含量和对照组差异不显著。本试验的中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏关系不显著原因可能与Cu 缺乏的程度有关。

CP作为一种抗氧化剂并且是组织中Cu的供体，不仅参与血浆Cu 的运输，也可清除机体内的O2-自由基，CP 具有类似超氧化物歧化酶的作用[10]。本试验中，血浆中CP（R=0.490，P=0.00）与血浆Cu 呈极显著正相关。Kincaid 等[11]研究表明，血浆CP与血浆Cu的相关系数为0.50；何宝祥等[12]报道，育成奶牛血浆CP 与血浆Cu 的相关系数为0.92，相关系数均高于本试验结果和Kincaid 等报道的结果。蔡永华等[13]报道，血浆CP 与血浆Cu 两者的相关系数可达0.50或0.64 并且成正相关，当补Cu 后血浆Cu 恢复正常，相关性明显降低，说明CP 活性与血浆Cu 密切相关，特别是血浆Cu 水平低时，相关性较高。王宗元和何宝祥都认为CP 测定有利于大范围的调查，且可代替血浆Cu 的检测[14]。本试验在相关性分析中显示CP可作为Cu 缺乏发生的风险因素（OR=1，P=0.012）。ROC 结果显示CP 可作为Cu 缺乏预警指标（AUC=0.709，P=0.001），临界值为13.7U/L。

综上所述，本试验中泌乳奶牛血浆中CP、TAOC 与铜缺乏密切相关，然而仅CP 可作为泌乳奶牛Cu 缺乏的风险预警指标。

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