鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留的UPLC-MS/MS检测方法研究

尹晖，孙雷，叶妮，王亦琳，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所，北京 100081)



鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留的UPLC-MS/MS检测方法研究

尹晖，孙雷，叶妮，王亦琳，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

为建立鸡蛋中硝基呋喃类代谢物(AOZ、AMOZ、AHD和SEM)残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS)，采用内标法定量，样品在酸性条件下衍生化后，弱碱性条件下用乙酸乙酯提取后，用正己烷去除脂肪，高速离心去除蛋白质等杂质，上机测试。液相色谱条件：色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相为甲醇+10 mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)，多反应监测(MRM)方式进行采集。结果表明：硝基呋喃类代谢物在0.5～20 ng/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系，相关系数(R2)均大于0.990。鸡蛋中四种代谢物的检测限均为0.25 ng/g，定量限均为0.5 ng/g。在0.5、1和5 ng/g三个添加浓度平均回收率为79.1%～109.4%，批内和批间RSD均小于20%。该方法具有简便快捷、灵敏度高、定性准确等特点。

鸡蛋；硝基呋喃类代谢物；超高效液相色谱-串联质谱

硝基呋喃类药物(Nitrofurans)是呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基团的一类人工合成抗菌药，临床常用的有呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮等，此类药物具有广谱抗菌作用，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫有杀灭作用。因此，常把该类药物添加到动物饲料中，防止细菌性传染病和作为促生长剂使用。Yndestad[1]研究发现呋喃唑酮及其代谢产物具有致突变和致癌作用。Kelly等[2]研究证明了硝基呋喃类药物是一种诱导有机体基因突变的有害物质。为此，欧盟早在1995年就禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗菌药物，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗菌药物的禁令，但硝基呋喃类药物及其代谢物残留仍不断被检出[3-4]。

由于硝基呋喃类药物原型在饲喂动物体内代谢迅速，数小时即可降解，而硝基呋喃类代谢物能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物，残留时间达数周之久，因此常通过检测硝基呋喃类代谢物来监测硝基呋喃类药物的使用情况。由于该类物质所要求的最低要求执行限(MRPL)为1 ng/g[5]，液相色谱等常规仪器达不到该类物质灵敏度的要求，因此欧盟、美国等国家都采用高灵敏、高选择性的液相色谱-串联质谱法对硝基呋喃类药物的代谢物进行确证检测。目前，在动物性食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测中，常用的方法主要是针对鸡肉等动物组织中的硝基呋喃类代谢物残留，而鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留检测方法[6]较少报道。且标准方法中样品前处理步骤繁琐，有必要进行改进。本文在现有标准方法的基础上，针对鸡蛋的组织特点，对前处理过程进行了简化，对样品净化进行了优化，建立了定性定量准确、抗干扰能力强、检测限低、测定快速的鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留检测的超高效液相色谱-串联质谱法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acquity UPLC-Quattro Premier液质联用仪，Waters公司； AE260电子天平，Mettler Toledo公司；BiofugeStrators高速冷冻离心机，贺利氏公司；Organomation Associates氮吹仪，Jnc公司；SIR4涡旋混合器，IKA公司。

1.2 药品和试剂 AOZ、AMOZ、AHD、SEM·HCl和内标AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-[1,2-15N2;13C，纯度均大于99.0%，北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，MERCK公司；正己烷为分析纯；所用水为超纯水。

1.3 对照溶液配制 精密称定AOZ、AMOZ、AHD和SEM对照品适量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液；量取标准储备液适量，用甲醇稀释成10 μg/mL的标准工作液，再用20%甲醇水溶液稀释成100 ng/mL的标准工作液。

1.4 测定方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相A相为甲醇，B相为10 mmol/L乙酸铵水溶液(梯度洗脱条件见表1)，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

注：1为即时变化，6为线性变化。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)，毛细管电压为3.8 kV，萃取电压为2.0 V，RF透镜电压为0.5 V，源温为110 ℃，雾化温度为350 ℃，雾化气速为650 L/h，锥孔气流速为50 L/h。多反应监测离子情况见表2。

表2 硝基呋喃类代谢物和内标的特征离子、锥孔电压和碰撞能量

1.4.3 定性与定量 定性时试样溶液中色谱峰的保留时间，应与校正溶液的保留时间一致，容许偏差为±5%，试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差符合欧盟2002/657/EC决议[7]要求。定量方法采用同位素内标法定量。

1.4.4 标准曲线绘制 准确配制0.5、1、2、4、10和20 ng/mL的系列混合对照溶液(含内标4 ng/mL)，经衍生化、提取、净化和浓缩后，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，按所得峰面积与相应内标峰面积的比值与相应的对照溶液浓度作标准曲线，并依次计算回归方程及相关系数。

1.4.5 样品前处理过程 称取2(±0.02)g匀质的鸡蛋样品于50 mL离心管内，加适量的AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-[1,2-15N2;13C]混合内标工作液、水4 mL、1 mol/L盐酸0.5 mL和50 mmol/L2-硝基苯甲醛的二甲亚砜溶液150 uL，涡旋混匀，(37±1)℃避光振荡水浴放置约16 h，衍生物中加入0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液5 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值至7.2～7.4，加乙酸乙酯5 mL，涡旋，中速振荡5 min，3000 r/min离心10 min，吸取上清液，再用乙酸乙酯5 mL重复提取一次，合并上清液，于50 ℃水浴下氮气吹干浓缩至干，用20%甲醇水溶液0.5 mL溶解残余物，并加入20%甲醇水溶液饱和的正己烷2 mL，涡旋混匀，4 ℃下5000 r/min离心5 min，去下清溶液过0.2 um滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.6 方法灵敏度确定 将适量AOZ、AMOZ、AHD和SEM对照溶液加入到空白鸡蛋中，经上述方法进行前处理后，用UPLC-MS/MS检测，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比(S/N)和对应药物浓度，S/N>3者定其为方法的检测限；S/N>10者定其为方法的定量限。

1.4.7 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白鸡蛋中各添加0.5、1、5 ng/g三个不同浓度药物进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求批内、批间RSD。

2 结果

2.1 标准曲线 按照上述系列标准溶液浓度进行线性回归，得到的回归方程及变异系数见表3。从表中可以看出AOZ、AMOZ、AHD和SEM在0.5～20 ng/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系，R2均>0.990。

表3 硝基呋喃类代谢物线性回归情况

2.2 方法灵敏度 按上述方法进行处理，当添加浓度为0.5 ng/g时，测得AOZ、AMOZ、AHD和SEM的S/N>10，说明方法定量限为0.5 ng/g。当添加浓度为0.25 ng/g时，测得四种药物S/N>3，表明方法检测限为0.25 ng/g。1 ng/g添加样品中AOZ、AMOZ、AHD和SEM及其内标特征离子质量色谱图见图1。

1:AHD(249.1>133.8)；2:AHD(252.1>133.8)；3:AOZ(236.2>133.8)；4:AOZ(240.2>133.8)；5:SEM(209.1>166)；6:SEM(212.1>168)；7:AMOZ(335.3>291.3)；8:AMOZ(340.3>296.3)。图1 1 ng/g空白鸡蛋添加样品中药物及内标特征离子质量色谱图

2.3 方法精确度 在空白鸡蛋中各添加三个不同浓度硝基呋喃类代谢物进行回收率试验，结果汇总见表4。可以看出鸡蛋中硝基呋喃类代谢物平均回收率为79.1%～109.4%，批内RSD为4.5%～9.1%，批间RSD为6.6%～10.2%。

表4 鸡蛋中硝基呋喃类代谢物添加回收率试验结果

3 讨论与小结

方法简化了鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留检测方法的前处理步骤，提高了操作简便性。在现有的标准方法中，前处理时通常要采取不同的洗涤方法对试料进行洗涤[8-9]，步骤繁琐，容易造成回收率降低。洗涤的目的在于去除影响质谱信号的干扰性杂质、游离态的硝基呋喃类代谢物以及外源性的SEM(氨基脲)等，而在鸡蛋中没有游离态的硝基呋喃类代谢物，因此本方法省去了洗涤步骤，这不仅简化了前处理过程，且有助于提高回收率。

另外，研究提高了净化效果，优化了净化过程。在硝基呋喃类代谢物残留检测过程中，发现样品的净化效果一直不够理想，常常导致液质联用仪的锥孔堵塞，影响上机效率，易损伤仪器，因此净化步骤亟需进一步优化。在目前常用的方法中，样品经过前处理仍残留有很多脂肪，本方法使用正己烷去除脂肪，采用高速离心的方式进一步去除蛋白质等杂质，大大提高了净化效果，优化了净化过程。通过方法线性、灵敏度、回收率和精密度等技术参数的考察，发现本方法均能满足残留检测方法的要求，定性定量准确，灵敏度高，为鸡蛋中硝基呋喃类代谢物残留检测提供了一个针对性强和更加简便快捷的选择。

[1] Steffenak I,Hormazabal V,Yndestad M.Reservoir of quinolone residues in fish[J].Food AdditContam,1991,Nov-Dec;8(6):777-780.

[2] Kelly B D,Heneghan M A,Bennani F,etal.Nitrofurantoin-induced hepatotoxicity mediated by CD8+ T cells[J].Am J Gastroenterol.1998 May;93(5):819-21.

[3] 陈威风，陈敬鑫．肉制品中硝基呋喃类药物残留的研究进展[J]．肉类研究，2011，25(12)：53—57．

[4] 禁用药物中孔雀石绿、氯霉素和硝基呋喃类使用频率高[J]．海洋与渔业，2011(11)：2．

[5] 欧盟.欧盟2003/181决议[S].

[6] 耿士伟，朱永林，邵德佳.高效液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中呋喃唑酮代谢物的残留[J].兽药与饲料添加剂，2005,10(5)：30-31.

[7] 欧盟.欧盟2002/657/EC决议[S].

[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 21311-2007，动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱-串联质谱法[S].

[9] 农业部.781号公告-4-2006，动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法[S].

(编辑：陈希)

Determination of Nitrofurans Metabolites Residues in Egg by UPLC-MS/MS

YIN Hui,SUN Lei,YE Ni,WANG Yi-lin,WANG He-jia,XU Shi-xin

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

An UPLC-MS/MS method was established for the determination of Nitrofurans metabolites residues in chicken egg.The samples were extracted by ethyl acetate in alkaline condition,then the fat was removed by n-hexane,and the protein was deposited by high speed centrifugation.LC conditions were as follows: the chromatography column is BEH C18 column of 50 mm×2.1 mm,1.7 μm,mobile phase is methanol and water(10mmol/L ammonium acetate),column temperature is 30 ℃,flow rate is 0.3 mL/min,injection volume is 10 μL.Mass spectrometry conditions were ESI+and MRM mode.And internal standard method was employed for quantification.The calibration curve of Nitrofurans metabolites were good linear from 0.5 to 20 ng/mL with the correlation coefficientR2over 0.990,respectively.The limit of detection of the method was 0.25 ng/g,and the limit of quantification was 0.5 ng/g.The average recoveries of Nitrofurans metabolites from spiked egg at three concentrations of 0.5,1 and 1.5 ng/g were 79.1%～109.4%,and intra- and inter-batchRSDwere <20%.

egg; nitrofurans metabolites; UPLC-MS/MS

2015年国家畜产品质量安全风险评估项目(GJFP2015008)

尹晖，硕士，从事兽药残留方面的研究工作。E-mail: yinhui@ivdc.gov.cn

2015-10-10

A

1002-1280 (2015) 12-0042-05

S859.84