UPLC-MS/MS检测七种动物源食品中四环素类药物残留量的研究

张鑫，吴剑平，李丹妮，严凤，曹莹，顾欣

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)



UPLC-MS/MS检测七种动物源食品中四环素类药物残留量的研究

张鑫，吴剑平，李丹妮，严凤，曹莹，顾欣*

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

研究并优化了七种不同动物源食品中四环素、土霉素、金霉素、多西环素残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。选用Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液作为提取液，超声提取七种动物源食品中四环素类残留，C18固相萃取小柱净化，脱溶剂后用甲醇水溶解，在超高效液相色谱-串联质谱上进行检测。结果显示，猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、牛奶中四环素类药物残留的最低定量限(LOQ)为10 μg/kg，猪肾、猪肝最低定量限(LOQ)为20 μg/kg，在定量限到2倍最大残留限量(MRL)的添加范围内，回收率为75%±25%,RSD<10%，可以满足农业部235号公告的要求。

兽药残留；四环素类；优化；超高效液相色谱-串联质谱

随着人民生活水平的提高，消费者对畜产品的需求更加多样化，对食品质量安全的要求也更高，四环素类等抗生素在动物性食品中的残留问题受到关注。四环素类药物是一类广谱抗生素，在畜禽、水生生物等产业领域应用此类药物可对动物进行诊断、预防和治疗疾病，同时促进动物生长、提高饲料转化率，带来可观的经济效益。养殖中滥用四环素类药物会导致动物体内该类药物的残留，人们长期食用这种动物食品及其制品，会危及身体健康。农业部在235号公告中规定了四环素类药物在动物性食品中最高残留限量(MRL)，以监管养殖业规范用药。目前已发布的检测标准(农业部958号公告-2-2007及GB/T 5009.116-2003)及文献方法多为液相色谱法[1-2]，检测限及灵敏度受到检测器的局限。已发布的液相色谱-质谱联用法检测标准有两个，GB/T 21317-2007中方法检测限定为50 μg/kg，且未涉及鸡蛋中四环素类残留量的检测方法，农业部1025号公告-12-2008仅适用于猪肉、鸡肉组织中四环素、土霉素及金霉素残留量的检测。已发表的相关文献[3-5]针对不同基质给出的检测方法各异，给实际监测工作带来了不便。本文在已有工作的基础上，针对我国消费量较大的猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、牛奶、猪肝、猪肾等7种组织，制定出相对统一的检测方法，通过考察前处理操作和仪器条件对结果的影响，优化检测方法，为实现动物源性食品中四环素药物残留的确证检测、有效监控四环素类药物的使用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters TQ Xevo串联四极杆质谱(ESI+)、固相萃取小柱(Waters HLB 3mL/60mg)、C18色谱柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；高速冷冻离心机(Allegra X-22R，美国Beckman Coulter)；水浴控温氮吹仪(N-EVAP，上海安谱公司)。标准品：土霉素(纯度98.5%)、四环素(纯度96.5%)、金霉素(纯度92%)、多西环素(纯度98.7%)，均为SIGMA公司生产。乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，德国Merk)；去离子水(自制，电阻率≥18 MΩ·cm)；草酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸，为化学纯；高纯氮、高纯氩(纯度均为99.999%，上海佳杰特种气体公司)。

标准溶液的配置：精密称取土霉素、四环素、金霉素、多西环素标准品各10 mg，用甲醇溶解制成1 mg/mL的标准贮备液。取土霉素、四环素、金霉素、多西环素贮备液适量，用甲醇配制成混合标准工作液，并用甲醇/水溶液(50:50，V/V)稀释成浓度为1、10、20、50、100 ng/mL的标准曲线。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱方法 色谱柱：C18柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸，采用梯度洗脱：20%A起始，4 min时变化至50%A，保持0.5 min，5 min时变化至20%A。

1.2.2 质谱方法 离子源：ESI+；检测方式：多反应监测MRM；电离电压3.2 kV；源温150 ℃；雾化温度500 ℃；锥孔气流速50 L/h；雾化气流速800 L/h。定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞电压见表1。

表1 四环素类药物的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞电压的参考值

1.2.3 前处理方法 提取方法：①猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼肉：称取5.00 g试样于50 mL离心管中，准确加入15 mL提取液(McIlvaine- Na2EDTA缓冲液[2])，充分振荡5 min，然后于0 ℃离心5 min(离心力8000 g)，转移至另一洁净离心管中，准确加入15 mL提取液重复提取一次，合并上清液备用。②猪肝、猪肾：称取5.00 g试样于50 mL离心管中，准确加入25 mL提取液，5%三氯乙酸5 mL，充分振荡10 min，于0 ℃离心5 min，上清液备用。③牛奶：称取5.00 g牛奶于50 mL离心管中，准确加入提取液定容至30 mL，充分振荡5 min，0 ℃离心5 min，上清液备用。

净化方法：HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水、提取液各3 mL活化。取备用液6 mL过柱，用3 mL 5%甲醇水淋洗，抽干，用0.01 mol/L草酸甲醇溶液4 mL洗脱，收集洗脱液，60 ℃下旋转蒸发至干，用1 mL甲醇/水溶液(50:50,V/V)溶解，过0.22 μm滤膜后上机测定。若待测样品浓度超出线性范围，用甲醇/水溶液(50:50,V/V)稀释至线性范围后上机测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系 土霉素、四环素、金霉素、多西环素标准曲线见图1，数据表明在1～100 ng/mL范围内，四种药物的线性相关系数R>0.999，线性良好。

图1 四环素类标准曲线(曲线浓度范围为1～100 ng/mL)(A：土霉素；B：四环素；C：金霉素；D：多西环素)

2.2 方法回收率 在确定样品预处理方法后，选择猪的肌肉、肝脏、肾脏，鸡肉、鸡蛋，牛奶，鱼肉作为测试对象，进行加标回收率实验，添加四环素类浓度为方法定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四个浓度的试样的样品，考察方法的准确性和精密度。同一浓度做6次平行实验，平均回收率R及标准偏差RSD见表2，结果表明，土霉素、金霉素、多西环素回收率达到70%～100%，四环素回收率达到50%～80%，RSD<10%，表明该方法对不同基质样品中不同含量的四环素类药物的测定均有较好的准确度(图2)。

表2 四环素类检测准确性和精密度数据结果表

图2 基质添加回收MRM谱图(A四环素类药物标准品20 ng/mL；B空白猪肉中添加20 ng/g； C空白牛奶中添加20 ng/g； D空白猪肾中添加20 ng/g)

2.3 灵敏度、检测限和定量限 UPLC-MS/MS对四环素类药物的检测灵敏度低至1 ng/mL(图3)，信噪比S/N(Peak to Peak)均远大于10，根据前处理方法的稀释倍数为1，推测方法定量限可定为1 μg/kg，检出限可以更低，但由于存在基质干扰，1 μg/kg添加回收率超出100%，定量不准，因此本方法不能简单用S/N>3来确定检测限，S/N>10来确定定量限，考虑到添加回收实验的结果，猪肉、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、牛奶中四环素类药物残留的最低定量限(LOQ)为10 μg/kg，猪肾、猪肝最低定量限(LOQ)为20 μg/kg，信噪比见图4所示。

3 讨论与小结

3.1 流动相的选择 通过比较四种流动相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01 mol/L三氟乙酸梯度洗脱，发现流动相中未加入0.1%甲酸的情况下，四环素类药物的电离效果较差，峰型对称性差，在加入一定比例的0.1%甲酸后，得到了改善，0.01 mol/L三氟乙酸也有类似的效果，考虑到0.1%甲酸更适合质谱，最终选择乙腈∶0.1%甲酸作为流动相。

图3 四环素类标准品MRM图(浓度为1 ng/mL)

图4 添加回收样品MRM图信噪比(A猪肉中四环素类药物添加浓度10 μg/kg；B猪肝中四环素类药物添加浓度20 μg/kg)

3.2 工作液稀释溶剂的选择 尝试选择溶剂分别为0.2%甲酸、0.2%甲酸/甲醇(80/20,V/V)、0.01 mol/L三氟乙酸/乙腈(50/50,V/V)、甲醇/水(20/80,V/V)、甲醇/水(50/50,V/V)等作为最终进样前的样品溶剂进行实验，发现溶剂pH值对样品的影响较大，而甲醇与水的比例对样品的影响较小，但高有机相比例的溶剂对样品残渣的溶解性较好，为保持一致，标准品的稀释溶剂选择甲醇/水(50/50,V/V)。

3.3 提取溶剂的选择 使用McIlvaine-Na2EDTA缓冲液、5%高氯酸溶液、乙腈三种提取溶剂，对四环素类药物添加量为20 μg/kg的猪肉样品进行提取，比较回收率发现，5%高氯酸溶液、乙腈对四种药物的提取效率均在53%～70%之间，当提取溶剂为McIlvaine-Na2EDTA缓冲液时多西环素和金霉素的提取效率有明显提高，分别达到74.8%和100.2%，而土霉素和四环素变化较小，分别为69.0%和65.3%，这主要是McIlvaine-Na2EDTA缓冲液竞争结合金属离子，一定程度上减少了四环素类药物与金属离子的螯合反应，保证药物的游离性，有利于药物在SPE柱上保留。

3.4 定量方法的选择 根据前处理实验情况发现，经过净化后，绝对回收在50%～60%，尝试选择去甲基金霉素作为内标，发现内标与四环素类药物的回收率不一致，因此仍选择外标法定量，通过改进前处理方法以提高回收率。

3.5 去除蛋白方法的选择 使用三氯乙酸(5%)、硅钨酸(5%)、高氯酸(1%，2%，5%，10%)、正己烷去脂、滤纸过滤等净化方法对猪肝样品(添加量为20 μg/kg)的提取液进行净化，比较回收率发现，对于不同基质，结果有所不同。对于猪肉、鸡肉、鱼肉、牛奶、鸡蛋等，加去蛋白或去脂的试剂意义不大，但对于猪肝、猪肾等，此步骤可以提高回收。使用三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)可得到相对较高的回收率，其中土霉素、四环素、多西环素和金霉素的回收率最高可达79.0%、68.2%、79.0%和98.5%。对于猪肝、猪肾样品，实验室可根据实际情况选择三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)作为净化试剂。

3.6 固相萃取柱的选择 比较了Waters HLB、BondElut C18、Agilent OPT固相萃取小柱的净化效率，后两者比HLB小柱略低，三种型号没有明显差异，C18填料的固相萃取小柱均可以满足要求。同时，比较规格为3mL/60mg和6mL/150mg的HLB固相萃取小柱，发现相同的上样量，6 mL小柱需要两倍体积以上的溶剂洗脱才能与3 mL的小柱回收率相当，增加工作量及成本，而回收率没有显著差别，因此选择规格为3mL/60mg的小柱。

3.7 固相萃取方法的选择 C18填料的固相萃取小柱，通常使用甲醇、水活化，但是，四环素类药物在弱酸性环境中更稳定，因此使用提取液(McIlvaine- Na2EDTA缓冲液)提供弱酸性柱上环境，发现回收率提高10%。同时，提取液上样量应与SPE填料量相匹配，考察了对3mL/60mgWaters HLB固相萃取小柱上样量分别为3、6、10 mL对回收率的影响，发现3 mL和10 mL均低于上样量为6 mL时的回收率。

实验结果显示，本方法具有灵敏度高、准确性好的优点，通过优化前处理和仪器条件，提高了回收率。本文考察了该方法对多种基质的适用性，并提出改进方案，给出不同基质的定量限，是对现有标准的改进和补充，可为动物源食品中的四环素类残留的检测提供可靠的确证方法。

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(编辑：侯向辉)

Optimized Determination of Tetracyclines in Seven Kinds of Animal Derived Food by UPLC/MS/MS

ZHANG Xin,WU Jian-ping,LI Dan-ni,YAN Feng,CAO Ying,GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A UPLC/MS/MS method for determination of the residues of tetracyclines(tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline)in seven different kinds of animal derived food was studied and optimized.The tetracyclines in seven kinds of animal derived food were pretreated with extraction by Na2EDTA-McIlvaine buffer solution，purification by C18 SPE column,dissolution by CH3OH/H2O(50/50,V/V) after desolvation，and then determined by UPLC/MS/MS.The results showed that the recoveries were in the range of 50%～100% when blank samples spiked with tetracyclines in 10 μg/kg or 20 μg/kg～2MRL,and the relative standard deviation was less than 10%.The method could satisfy the request of legislation on maximum residue limits in the ministry of agriculture 235 announcement.

veterinary residue；tetracyclines；optimize；UPLC/MS/MS

上海市市级农口系统青年人才成长计划(沪农青字(2014)第2-5号)；上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字(2013)第6-9号)

张鑫，硕士，畜牧师，从事兽药残留分析研究。

顾欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-10-27

A

1002-1280 (2015) 12-0036-07

S859.84