HPLC法同时测定复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸的含量

徐刚，吴学渊，房春林

(1.成都农业科技职业学院，成都 611130；2.成都乾坤动物药业有限公司，成都 611130)



HPLC法同时测定复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸的含量

徐刚1，吴学渊2，房春林1

(1.成都农业科技职业学院，成都 611130；2.成都乾坤动物药业有限公司，成都 611130)

为了建立复方蒲公英颗粒的可控质量标准，建立了同时测定复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸含量的高效液相色谱法，并测定样品中两种成分的含量。采用WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)为流动相，体积流量为1.0 mL/min，检测波长为326 nm，柱温为25 ℃。结果表明，秦皮乙素和咖啡酸分别在0.02～0.32 mg/mL和0.004～0.064 mg/mL浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系(R2=0.9999)，平均加样回收率分别为100.08%和99.69%，RSD分别为0.98%和0.84%。本方法准确、灵敏、可靠，重现性好，可用于复方蒲公英颗粒产品的质量控制。

高效液相色谱法；复方蒲公英颗粒；秦皮乙素；咖啡酸

复方蒲公英颗粒为本单位研发中的新兽药产品，由蒲公英、紫花地丁、甘草等四味中药组成，前期研究表明，本制剂具有清热解毒，凉血消肿的功效，主要用于猪外感热病的辅助治疗，症见体温升高、口渴贪饮等。咖啡酸为蒲公英的主要有效成分之一，具有显著的抗菌，抗病毒，中枢兴奋等作用[1-2]，秦皮乙素为紫花地丁主要有效成分之一，具有明显的抗炎、抑菌、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用[3-4]。中兽药复方制剂的化学成分复杂，产品质量的控制往往需要检测多种有效成分，而每种成分的检测方法和条件往往各有差异，程序繁琐复杂，耗时较长，工作量大，因此，在进行中兽药复方制剂特别是新兽药复方制剂研发中，建立对产品中与疗效相关的多种成分含量同时进行测定的HPLC方法，能够大大加快分析检测速度，具有重要的价值和实际意义。因此，为了建立复方蒲公英颗粒的可控质量标准，试验选择秦皮乙素和咖啡酸作为指标成分，对两种成分的含量测定方法进行了研究，由于分别建立两种成分的检测方法费时费力，为提高产品质量控制效率，研究旨在建立同时测定复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸含量的高效液相色谱法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 1260 infinity高效液相色谱仪,Agilent公司，OpenLAB CDS色谱数据工作站，四元泵、自动进样器、紫外检测器；KQ5200DE超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司；CPA225D型电子分析天平,德国Sartorius公司，十万分之一；甲醇为色谱纯,Fisher公司，水为注射用水，其它试剂均为分析纯。

1.2 标准品和样品 秦皮乙素对照品,批号：110741-200506，由中国食品药品检定研究院提供；咖啡酸对照品,批号：110885-200102，由中国食品药品检定研究院提供；复方蒲公英颗粒,批号：130501，130502，130503，由成都乾坤动物药业有限公司研制。

1.3 溶液配制

1.3.1 混合对照品溶液 精密称取咖啡酸对照品20 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；另取秦皮乙素对照品20 mg，置50 mL容量瓶中，用配制好的咖啡酸对照品溶液溶解并定容至刻度；取该混合对照品溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含咖啡酸和秦皮乙素浓度分别为0.016 mg/mL、0.08 mg/mL的混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液 取复方蒲公英颗粒粉末约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率200 W，频率32 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 阴性样品溶液 取缺蒲公英和紫花地丁的双阴性样品颗粒，按供试品溶液的制备方法制备。

1.4 检测方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为岛津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)，体积流量1.0 mL/min，检测波长326 nm，柱温25 ℃。

1.4.2 测定方法 取3批复方蒲公英颗粒(批号130501、130502、130503)，按1.3项方法制备混合对照品溶液和供试品溶液，分别取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件进样，记录色谱图和峰面积，以外标法计算各成分含量。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性 分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，按1.4.1项色谱条件进样，记录色谱图和峰面积。

1.5.2 线性范围 精密称取咖啡酸对照品、秦皮乙素对照品，用甲醇稀释至含秦皮乙素浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mg/mL，含咖啡酸浓度分别为0.004、0.008、0.016、0.032、0.064 mg/mL的混合对照品溶液，分别吸取各混合对照品溶液10 μL，进样，记录峰面积值；以峰面积(y)对对照品浓度(x)进行线性回归。

1.5.3 精密度试验 分别取混合对照品溶液，按1.4.1项色谱条件，重复进样6次，记录色谱图和峰面积，并计算RSD值。

1.5.4 稳定性试验 取混合对照品溶液与供试品溶液，按1.4.1项色谱条件分别于0、2、4、6、8、10h进样测定，记录色谱图和峰面积，并计算RSD值。

1.5.5 重复性试验 取复方蒲公英颗粒约3g，分别按1.3.2项方法制备供试品溶液，平行制备6份，进样测定，记录色谱图和峰面积，以外标法计算各成分含量。

1.5.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的复方蒲公英颗粒约1.5g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入秦皮乙素对照品储备液(0.178mg/mL)和咖啡酸对照品储备液(0.0344mg/mL)各5mL，精密加甲醇15mL，平行操作6份，按1.3.2项方法制备加样回收供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积和色谱图，并计算加样回收率。

2 结果

2.1 含量测定 结果表明,不同批次复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸的含量稳定，产品质量稳定、可控。本方法可用于同时测定复方蒲公英颗粒中秦皮乙素和咖啡酸含量。试验结果见表1。

表1 复方蒲公英颗粒样品含量测定结果(n=3)

2.2 专属性

结果表明，在秦皮乙素和咖啡酸色谱图相应位置无干扰峰出现，证明本样品含量测定方法专属性强。结果见图1。

A.混合对照品溶液HPLC色谱图 B.供试品溶液HPLC色谱图 C.阴性样品溶液HPLC色谱图 1.秦皮乙素 2.咖啡酸图1 复方蒲公英颗粒液相色谱图

2.3 线性范围、精密度和稳定性试验 秦皮乙素回归方程为：y=29829.884x-10.140，R2=0.9999，咖啡酸回归方程为：y=53817.627x-10.482，R2=0.9999，秦皮乙素和咖啡酸分别在0.02～0.32mg/mL和0.004～0.064mg/mL浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系。精密度试验结果表明，两种成分RSD均小于1.5%。对照品溶液及供试品溶液在10h内稳定性良好，RSD均小于1.5%。

2.4 重复性试验 测得秦皮乙素的平均含量为0.615mg/g，RSD小于1.5%，咖啡酸的平均含量为0.134mg/g，RSD小于1.5%，表明本方法的重复性良好。

2.5 加样回收率试验 结果表明，秦皮乙素回收率平均值为100.08%，RSD为0.98%，咖啡酸回收率平均值为99.69%，RSD为0.84%，表明本方法可靠，准确度好。结果见表2、表3。

表2 秦皮乙素加样回收率试验结果

表3 咖啡酸加样回收率试验结果

3 讨论与小结

紫花地丁和蒲公英均为复方蒲公英颗粒处方中的主要药材，其中紫花地丁主要有效成分之一为秦皮乙素，《中国兽药典》2010年版尚未收载其含量测定方法，蒲公英主要有效成分之一为咖啡酸，其含量较低，《中国兽药典》2010年版中规定药材含咖啡酸量不得少于0.02%，在进行本制剂质量研究时，在参考文献资料[6-7]和多次对比试验的基础上，兼顾两种成分在药材中的含量高低，通过综合比较两种成分的物理化学性质以及流动相极性的特点，最终采用HPLC法对两种药材中的两种成分同时进行含量测定研究，对样品取样量、吸收波长、色谱柱类型等条件进行了系统的考察。

对检测波长的筛选研究表明，秦皮乙素在353 nm处有最大吸收，咖啡酸在326 nm处有最大吸收，试验对样品在秦皮乙素和咖啡酸各自最大吸收波长下的分离情况和峰面积进行了对比，结果表明，在353 nm波长条件下，咖啡酸峰面积极小，杂质干扰严重，不能满足含量测定要求，而在326 nm波长条件下，秦皮乙素和咖啡酸两种成分均有良好的吸收峰，无明显杂质干扰，因此确定检测波长为326 nm。

根据文献报道的色谱条件[7-8]，对复方蒲公英颗粒剂中秦皮乙素和咖啡酸两种成分进行同时测定含量研究时，两种成分的色谱峰存在相互干扰，分离度差，杂质成分干扰也很严重，峰面积差异大。为此，分别采用甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)和乙腈-0.6%冰醋酸水溶液(8∶92)作为流动相，对Agilent -ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)和岛津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)两种色谱柱的样品成分分离情况进行了对比试验，结果发现采用岛津WondaCract ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-0.6%冰醋酸水溶液(20∶80)作为流动相，所检测的两种成分分离效果较好。在对柱温条件的优化筛选试验中，分别比较了柱温在20℃、25℃、30℃、35℃等条件下两种成分分离情况以及峰形情况，结果表明，在25℃和30℃时两成分色谱峰可达到基线分离，且与其它杂质成分分离较好。

本研究建立的同时测定复方蒲公英颗粒剂中秦皮乙素和咖啡酸含量的HPLC方法，具有简便、准确、快速的特点，极大地提高了工作效率，并节约了人力物力，可用于复方蒲公英颗粒产品的质量控制。同时本方法也可为紫花地丁药材含量测定方法的建立奠定基础，也为其他同时含有该两种成分的制剂进行质量控制提供参考依据。

[1] 凌云,张雅林,蔡少青，等.蒲公英黄酮类和甾醇类成分的研究[J].中国药物化学杂志，1998，8(1)：46-48.

[2] 屠国昌.蒲公英化学成分、药理作用和临床应用[J].海峡药学，2012，24(5): 33-35.

[3] 蒋喜巧，苗明三.蒲公英现代研究特点及分析[J].河南中医学院学报，2015，(7): 1024-1026.

[4] 黄霁秋，杨敬芝，薛清春，等.紫花地丁化学成分研究[J].中国兽药杂志.2009，34(9): 1114.

[5] 刘湘新，刘进辉，刘自逵，等.紫花地丁的有效成分分析及抗菌作用研究[J].中兽医医药杂志，2004，23(3):16-18.

[6] 陈胡兰，汤沛然，张梅.不同产地紫花地丁中秦皮乙素的含量比较[J].成都中医药大学学报，2010，33(1)：72-74.

[7] 中国药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[S].

[8] 孟繁姝，赵春杰，李丹，等.HPLC法同时测定蒲丁合剂中秦皮乙素和咖啡酸的含量[J].中国药品标准，2009，10(1)：38-40.

(编辑：陈希)

Simultaneously Determination of Aesculetin and Caffeic Acid in Compound Dandelion Granule by HPLC

XU Gang1,WU Xue-yuan2,FANG Chun-lin1

(1、ChengduVocationalCollegeofAgriculturalScienceandTechnology，Chengdu611130,China; 2、ChengduQiankunVeterinaryPharmaceuticalCo.,Ltd，Chengdu611130,China)

In order to improve the quality standard of compound dandelion granule,an HPLC method was established for simultaneously determination of aesculetin and caffeic acid in compound dandelion granule.The isolation was performed on a WondaCract ODS-2 column(4.6 mm×250 mm,5 μm) with mobile phase consisting of methanol-0.6% glacial acetic acid(20∶80).The flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 326 nm and the column temperature was 25 ℃.The results showed that good linear relationship was obtained in the range of 0.02～0.32 mg/mL and 0.004～0.064 mg/mL respectively (R2=0.9999).Theaveragerecoveriesofaesculetinandcaffeicacidwere100.08%and99.69%withRSDof 0.98% and 0.84%.The method was accurate,sensitive and reliable with a good reproducibility and can be used as an quantitative analysis of aesculetin and caffeic acid in compound dandelion granule.

HPLC；compound dandelion granule；aesculetin；caffeic acid.

徐刚，硕士，副教授，从事动物疫病防治及新兽药研发工作。E-mail：625406758@qq.com

2015-10-30

A

1002-1280 (2015) 12-0047-04

S853.73