尖孢镰刀菌引起的杭白菊叶枯病

王呈辉，马婉琴，楼钰函，倪炎栋，蔡 苏 ，钱永生，吴剑丙

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 3 10036)

杭白菊 (white Chrysanthemum morifolium)系菊科多年生草本植物，也称杭菊、茶菊，是著名的“浙八味”之一［1］。作为传统的栽培药用植物，杭白菊被广泛应用于中药调理、养生饮品等方面，深受广大消费者的青睐［2-3］。近年来因连作、重肥、气候、环境等因素，使杭白菊病害问题日益突出。其中的典型病害就包括叶枯病、根腐病、病毒病等［4］。在实际生产中，由于农民常常缺乏必要的病害识别与无害化治理技术，不合理使用化学农药，造成农药污染和药品残留超标，并引发病菌的耐药问题，严重影响了杭白菊的安全卫生质量，也在一定程度上影响了其药理品质，更成为制约杭白菊产业健康持续发展和出口创汇的重要障碍。因此，对杭白菊主要病害的病原菌鉴定、致病机制及防治策略的系统研究迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用杭白菊染病植株和健康植株均于2014年6月采集自杭州桐乡地区。Taq DNA polymerase购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;PCR产物克隆试剂盒购自生工生物工程 (上海)股份有限公司;其余常用化学试剂均由浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 致病真菌的分离纯化

将处理过的表现叶枯症状的杭白菊枝叶植入PDA培养基平板中，每皿植入4～5块，用封口膜密封，置25℃培养箱中黑暗倒置培养［5］。每隔12 h观察1次，待茎、叶切面处长出菌丝后，挑尖端部分移至新的PDA平板上，25℃黑暗培养，经反复传代纯化后，即得到致病真菌纯培养物，并于PDA斜面4℃保存。

1.2.2 致病菌形态鉴定

将分离纯化后的菌接种到PDA平板上培养，记录分离菌落培养的大小、形态、颜色、色素分泌、产孢等性状及菌丝孢子形态。

1.2.3 菌株分子鉴定

收集纯培养真菌菌丝，采用Lysis法提取基因组DNA［6］并检测，以此DNA为模板进行PCR扩增(引物为 ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇))及测序分析，获得的真菌ITS序列提交到GeneBank数据库进行BLAST同源检索，得到相对应的同源基因序列，明确所测菌株的分类地位［7］。

1.2.4 致病性测定

将活化后的致病菌菌丝接种到PDB液体培养基中，25℃下170 r·min-1培养2～3 d，获得大量真菌孢子。将真菌孢子稀释成不同浓度梯度 (104，106，108spores·mL-1)，接种于健康无病的杭白菊叶片上，在适宜的湿度和温度 (20，25，30℃)下培养。每24 h观察记录叶片的发病症状，并以等剂量的ddH2O作为空白对照［8］。待叶片表现症状后对病斑进行组织分离，鉴定分离病菌是否与原始病菌相同。

2 结果与分析

2.1 致病菌形态鉴定

从表现叶枯症状的杭白菊枝叶中共分离纯化获得26个菌株。将菌株分别接种到PDA平板上培养4～5 d，记录菌落形态。观察发现，所分离到的菌株菌落呈白色棉絮状，菌丝饱满致密，几乎布满整个平板 (图1)。同时，挑取平板内的菌丝，制成临时装片，荧光显微镜下观察菌丝及孢子形态。镜检观察菌丝细胞质均匀，直长少分支，节间较长，并有大量镰刀形的小型分生孢子 (图2)。

2.2 致病菌分子鉴定

随机选择部分菌株，扩增获得真菌rDNA ITS区段约500 bp。扩增获得的片段经PCR产物纯化

图2 菌丝及孢子形态

图1 菌落形态后送公司测序，经序列分析后得到各菌株ITS序列(图 3)。将测序获得的真菌 ITS序列提交到GeneBank数据库进行BLAST同源检索，得到同源基因序列，进行进化分析发现，所得致病菌与尖孢镰刀菌 (Fusariam oxysporum)同源性最高，为同一属真菌 (图4)。

2.3 致病性测定

测定不同温度和浓度条件下病原菌的致病性发现，接种温度20℃、孢子浓度为108spores·mL-1时发病最为严重。接种2～3 d后，叶片先端变黄，再由局部扩展到整个叶缘，呈褐色至红褐色的叶缘病斑。其后病斑逐渐向叶片基部蔓延，直至整个叶片变为褐色或灰褐色［9］。病斑与健康组织交界明显，病斑边缘呈波纹状，颜色较深，外缘部分可见鲜黄色线带。最后病斑明显增大，扩散边缘出现参差不齐的现象，病健组织的界限不明显 (图5)。

图3 ITS序列

图4 真菌ITS序列系统进化树

3 小结与讨论

图5 致病性测定

目前针对杭白菊的病害研究工作多停留在病害症状的介绍上［10-11］。本试验从表现叶枯症状的杭白菊枝叶中共分离获得真菌菌株26株，采用详细的形态学与分子生物学方法，鉴定其为尖孢镰刀菌(F．oxysporum)。将致病菌孢子重新接种回健康叶片，经一段时间后表现出叶枯病症状，完成科赫氏法则验证，确定所分离得到的尖孢镰刀菌确实为杭白菊叶枯病致病菌。此前一些研究认为，菊花叶枯病由半知菌亚门菊壳针孢 (Septoria chrysantheme Ua Sacc.)侵染所致，初期叶片上出现圆形或椭圆形大小不一的紫褐色病斑，病斑周围褪绿，中部呈灰白色，后期出现黑色小点，逐渐扩展致叶片枯死［11］，而尖孢镰刀菌多引起根腐病［11-12］。本研究则证实尖孢镰刀菌也是引起杭白菊叶枯病的元凶之一，扩大了杭白菊叶枯病病原菌范围，在生产中应引起重视并加以合理的管理。

［1］ 金建忠，闻鸣，申屠超.杭白菊化学成分最新研究进展［J］.食品工业科技，2014，35(15):386-389.

［2］ Liang F J，Hu C F，He Z C.An arabinogalactan from flowers of Chrysanthemum morifolium:structural and bioactivity studies［J］.Carbohydrate Research，2014，387:37-41.

［3］ Wang T，Guo Q S，Mao P.Flavonoid accumulation during florescence in three Chrysanthemum morifolium Ramat cv.‘Hangju’ genotypes［J］. Biochemical Systematics and Ecology，2014，55:79-83.

［4］ 周丽，张维，王斌.杭白菊的有效成分及深加工研究进展［J］.食品工业，2014，35(6):199-202.

［5］ 张伟，刘保友，盖中帅，等.黄瓜枯萎病菌生物学特性的研究 ［J］.山东农业科学，2011(10):70-73.

［6］ 杨宇虹，梁东春，郭刚，等.改进Trizol法提取基因组DNA［J］.医学分子生物学杂志，2006，2(3):105-107.

［7］ 徐晓舒，余祥单，王庆容.丁鱥体内3株可疑致病真菌的分离鉴定与生物学特性初步研究［J］.广东农业科学，2013(15):142-144.

［8］ 施俊凤，薛梦林，张晓宇，等.丰水梨贮期病原菌种类及侵染规律［J］.山西农业科学，2011，12(39):1307-1309.

［9］ 潘兰兰，郑永利，吕先真.白术主要病害的发生及综合治理［J］.浙江农业科学，2006(3):315-317.

［10］ 闻玉田.杭白菊栽培及主要病虫害防治技术［J］.农机服务，2013，30(1):73-74.

［11］ 张春桃，陈轶，蔡建武，等.观赏性杭白菊病虫害综合防治及无公害栽培技术［J］.中国植保导刊，2010，30(3):25-31.

［12］ 沈清清，刘芳，胡彦.药用植物根腐病病原菌研究进展［J］.北方园艺，2014(11):187-190.