金线莲组培快繁体系优化及多糖含量测定

袁小铃，王建栋，王思雨，张熠玲，刘洪波，邵清松，梅璟妍，王红珍

(浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江临安 3 11300)

金线莲也叫金线兰，为兰科开唇兰属(Anoectochilus)花叶开唇兰和金线兰 (A．formosanus Hayata)的全草。其味甘、性平，具有凉血祛风，除湿解毒、强心利尿、固肾平肝等功效，主治肾炎、肺炎、高血压、糖尿病、高血压、乙型肝炎等症［1-2］。在民间有“药王”或“神草”之称。金线莲含有金线莲苷、黄酮类、多糖、挥发油、甾体和三萜类化合物、维生素和矿物元素等［1］。其中植物多糖有调节免疫能力、抗肿瘤、降血糖、抗衰老、保肝等功效［3］。

金线莲种子发芽率低，根系不发达，再加上各种病原物的侵袭，生态环境的破坏和人类的过度采挖，使野生金线莲资源处于濒临枯竭的状态。目前常用1～2 cm茎段作为外植体的微扦插法获得种苗用于人工栽培，因为繁殖系数低，并不能有效缓解金线莲原植物资源匮乏的现状。本文对金线莲组培快繁技术进行优化，并对多糖含量进行测定，以确定组培苗能否代替微扦插苗作为种苗用于人工栽培，以缓解金线莲资源匮乏的现状。

1 材料与方法

1.1 植物材料

花叶开唇兰 (A．Roxburghii)无菌苗在16 h光照/8 h黑暗和25℃条件下生长至株高5～6 cm。选用不同长度 (带节和节处断开)的茎段为外植体，接种到不同培养基上进行诱导愈伤组织、丛生芽、生根培养等。

1.2 超声波辅助法提取金线莲多糖

用超声波辅助法提取金线莲多糖［4］，金线莲恒温干燥粉碎后过40目筛，称取适量粉末，按料液比1∶35加入超纯水，60℃超声30 min，4 200 rpm·min-1离心15 min，收集上清。重复提取残渣3次，合并3次提取液。上清中加入活性炭进行脱色处理，抽滤后真空旋转蒸发至10 mL，加入40 mL无水乙醇，4℃过夜沉淀多糖，离心收集沉淀后溶于40 mL超纯水。测定多糖含量，每个样品重复3次。

1.3 苯酚-硫酸法测定金线莲多糖含量

5%苯酚溶液的配制。将苯酚晶体加热融化，取5 mL苯酚溶液加水定容至100 mL，装入棕色瓶中避光备用。

葡萄糖溶液的配制。葡萄糖105℃恒温干燥2 h，冷却至室温，配制成浓度为1 mg·mL-1的标准液，4℃保存备用。分别取标准液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，加蒸馏水至2.0 mL，分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液混匀和浓硫酸5.0 mL，摇匀后静置10 min，紫外分光光度计测定器490 nm处的吸光度 (D490)。

供试品的配制。量取0.2 mL多糖溶液，加水定容至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混匀，加浓硫酸5.0 mL，摇匀后室温放置10 min，测定D490值。

1.4 分析方法

Grubbs检测 (G=|估计值-平均值|/标准方差)去除与全体观测值偏离较大的数据，当样品数为3时，G大于1.155时，去除相应的数值所得［5］。

2 结果与分析

2.1 金线莲组培快繁技术的优化

以MS+3%蔗糖+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%琼脂粉为基础培养基，按6-BA终浓度为5.0，4.5，4.0，3.0，2.5，2.0和1.0 mg·L-1加入不同体积的浓度为1 mg·mL-1的母液。在上述培养基上分别接种长度为0.5～1.0 cm茎段(含节)，0.3～0.5茎段 (含节)，0.3～0.5 cm茎段 (节结处分开)，结果发现，在6-BA终浓度为4.0，3.0 mg·L-1时的培养基，即6-BA/NAA为8∶1和6∶1时，可诱导3种外植体产生愈伤组织，0.3～0.5 cm茎段 (节结处断开)产生愈伤组织数目最多。与6-BA/NAA为8∶1的培养基相比，在6-BA/NAA为6∶1培养基上，3种外植体产生的愈伤组织数目较高。因此，选用6-BA/NAA为6∶1为诱导愈伤组织的激素配比。

在MS+3%蔗糖 +6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%琼脂粉培养基(Ⅰ)中添加3%活性炭，接种0.3～0.5 cm节结处断开的茎段，结果发现，0.3%活性炭的加入对愈伤组织和丛生芽的形成并无明显促进作用 (图1中A)，且抑制丛生芽的形成和生长发育 (图1中B)。结果表明，Ⅰ培养基上可产生大量丛生芽(图1中C)，丛生芽诱导率 (不定芽数目/外植体数目)达30%～40%。生根培养基为MS+3%蔗糖+0.5 mg·L-1NAA+20%香蕉泥+0.9%琼脂粉。生根苗于泥炭和河沙料中炼苗，并用塑料薄膜覆盖，15 d后人工种植。

图1 金线莲组培快繁体系优化

2.2 多糖含量测定

分别吸取 1 mg·mL-1的标准液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，加蒸馏水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀后静置10 min［6］，测定 D490值。以标准液浓度为横坐标，D490值为纵坐标，所得标准曲线为y=26.81x+0.003 5;R2=0.998 5。

组培苗多糖 D490值分别为 0.305，0.309，0.310(表1)，根据标准曲线计算3个重复样品多糖浓度分别为4.50，4.56，4.57 mg·mL-1，平均多糖浓度为4.54 mg·mL-1，栽培苗中多糖含量分别为17.88%，18.21%和16.63%，平均含量为17.57%;微扦插苗多糖 D490值分别为 0.296，0.302，0.280(表2)，计算其多糖浓度分别为4.36，4.45，4.13 mg·mL-1，平均浓度为 4.31 mg·mL-1，微扦插苗多糖含量分别为17.46%，17.53%，16.58%，平均为17.19%。两者多糖含量无显著差异。

表1 组培苗和微扦插苗的多糖含量

3 小结和讨论

在MS+3%蔗糖+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%琼脂粉中添加0.3%活性炭对愈伤组织诱导、丛生芽的生长和数量并无明显影响，但略为抑制丛生芽的形成和生长，可能是活性炭吸附了培养基中的某些营养成分，导致添加活性炭反而不利于丛生芽的生长发育。在MS+3%蔗糖+3 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+20%橡胶泥+0.9%琼脂粉上可形成大量的丛生芽，丛生芽诱导率 (不定芽数目/外植体数目)远高于用茎片和茎段作为外植体诱导不定芽的诱导率［7-9］。说明在节处断开的茎段作为外植体，可诱导更多的愈伤组织和丛生芽，可能是因为植物节部位的居间分生组织在诱导愈伤组织和存生芽的过程中发挥中一定的作用。

通过优化组培快繁技术，使金线莲的不定芽/外植体达到30～40，远高于微扦插不定芽/外植体1～2，极大增强了濒危金线莲资源的繁殖系数，同时，其重要的活性成分，如多糖含量并无明显差异，因此利用组培苗代微扦插苗作为种苗，是缓解金线莲资源紧缺的有效途径。

［1］ 南京中医药大学.中药大辞典［M］.2版.上海:上海科学技术出版社，2005.

［2］ 福建中医药研究所.福建药物志第2册 ［M］.福州:福建科技出版社，1982:215.

［3］ 钱青，张志勇.植物活性多糖的药理作用及应用研究进展［J］.华西医学，2009，24(1):250-252.

［4］ 秦文玲.五倍子多糖的提取及其抗氧化和抑菌特性研究［D］.成都:成都理工大学，2008.

［5］ Miller J，Miller J.Statistics and chemometrics for analytical chemistry［M］.6thed.Ontario:Pearson Education Canada Inc，2010..

［6］ 田广文，陈德育，李学俊，等.猪苓多糖苯酚-硫酸法测定条件的优选［J］.中国农学通报，2007，23(7):75-78.

［7］ 冯亦平，张利平，王岩花，等.金线莲外植体的筛选及不定芽诱导的研究［J］.种子，2009，28(10):19-22.

［8］ 王雅英，林小华，洪璇.金线莲外植体筛选及愈伤组织诱导研究 ［J］.亚热带植物科学，2011，40(3):41-43.

［9］ 杨清林，管天冰，戴传云.台湾金线莲丛生芽的诱导与增殖研究 ［J］.安徽农业科学，2012，40(17):41-43.