A型流感金标快速检测试纸条的研制及初步应用

高海岗 王子平 任晓晔 陆建荣

（苏州市动物卫生监督所，江苏苏州 215000）

A型流感金标快速检测试纸条的研制及初步应用

高海岗 王子平 任晓晔 陆建荣

（苏州市动物卫生监督所，江苏苏州 215000）

H5N1、H7N9、H9N2禽流感的频发，给养鸡业带来极大的经济损失，同时，给公共卫生带来了极大的挑战。为了快速检测出流感感染的畜禽，利用两株抗禽流感病毒NP蛋白特异性单克隆抗体3F3，4F11研制了禽流感（AIV）快速检测试纸条。结果表明该试纸条有良好的特异性，与H5、H7、H9均有良好的反应性，与鸡新城疫病毒、鸡白血病病毒没有交叉反应。应用该检测试纸条检测300份临床样本，与进口试剂条检测结果做比较，吻合率达91.6%，其中H5吻合率达100%，H9吻合率达85.1%。该试纸条的研制，为基层快速检测禽流感提供了条件。

流感 检测 试纸条

自我国2000年爆发流感以来，相继发生H5N1、H9N2、H7N9多型流感。流感病毒为RNA病毒，正粘病毒科，快速检测畜禽体内是否感染流感病毒，比较免疫前免疫后带毒水平，具有极高的公共卫生意义。本研究利用2株抗AIV-NP蛋白特异性单克隆抗体3F3，4F11研制了AIV快速检测试纸条，具有良好的特异性和较高的敏感性。

1 材料

1.1 主要试剂与材料

氯化金、柠檬酸三钠、BSA购自Sigma，抗AIV-NP蛋白特异性单克隆抗体3F3、4F11来源于扬州大学，NC膜、玻璃纤维购自上海捷宁生物科技有限公司、吸水纸、PVC地板购自苏州众达。

1.2 主要仪器

数显磁力搅拌加热器，购自常州；紫外分光光度计，购自上海；连续划膜仪、喷金仪，购自杭州。

2 方法

2.1 胶体金的制备

准确量取100 ml的超纯水，倒入洗净的锥形瓶中，把锥形瓶放在电炉上加热，然后用移液枪移取1 ml 1%的氯化金溶液加入到超纯水中，终浓度为0.01%，煮沸。待其沸腾后加入一定量的1%的柠檬酸三钠溶液，振荡混匀。待煮至颜色发生变化后，计时5 min，之后取下锥形瓶，冷却至室温。

2.2 胶体金-抗体复合物的制备

2.2.1 确定最佳pH

取1 ml的胶体金，加0.2 M碳酸钾调不同的pH；缓慢加入单克隆抗体3F3到胶体金溶液中，搅拌45 min；稳定后加10%的NaCl 溶液至终浓度1%，30 min后观察。

2.2.2 确定最佳标记蛋白量

取1ml的胶体金，加碳酸钾调至最佳的pH；缓慢加入不同浓度的单克隆抗体3F3到胶体金溶液中，搅拌45 min；稳定后加10%的NaCl 溶液至终浓度1%，30 min后观察。

2.2.3 制备胶体金-抗体复合物

取10 ml的胶体金，加碳酸钾调至最佳的pH；缓慢加入到适量的单克隆抗体3F3至胶体金溶液中，搅拌45 min；加入10%BSA至终浓度1%，搅拌40 min；4 ℃，离心，弃去上清，用复溶液复溶至原体积的20%。

2.3 试纸条的制备

2.3.1 C线、T线制备

C线用羊抗鼠二抗，浓度为1.0 mg/ml，1.5 mg/ml，2.0 mg/ml，划膜。T线用4F11单克隆抗体，浓度为0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml，划膜。

2.3.2 金标垫制备

取制备的浓缩金标抗体，按照15、20、25、30、35 μl/cm不同的喷量均匀喷涂于玻璃纤维，37 ℃烘干。

2.3.3 试纸条组装

将金标抗体、吸水纸、样品垫按顺序组装，按照4.0 mm切条，测试效果。

2.4 试纸条性能检测

2.4.1 特异性检测

分别用ALV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9亚型灭活流感病毒，PBS稀释液，检测试纸条特异性。

2.4.2 灵敏度检测

用原核表达的AIV-NP蛋白按照不同的稀释倍数，检测试纸条的灵敏度。

2.4.3 稳定性检测

随机选取同批次的10根试纸条以及不同批次的各10根试纸条用相同抗原检测，检测其稳定性。

2.4.4 临床样本检测

检测临床样本300份，同时用进口试纸条检测，检测其样本符合率。

3 结果

3.1 最佳pH

当加入10%NaCl溶液20 min后，pH在7.0后颜色不变。取不同pH值的金标抗体，测其OD526值并绘制曲线，确定金标抗体的最佳标记pH值为8.94。

3.2 最佳标记蛋白量

将胶体金pH值调到894，每毫升胶体金标记不同量的抗体，加入10%NaCl溶液后，发现标记的蛋白量从15 μg后开始稳定，颜色不再变化。取标记不同蛋白量的金标抗体，测其OD526值，绘制曲线，确定最小标记抗体量为 15μg，所以最佳标记量定为18μg。

3.3 试纸条组装测试

将C线、T线、金标抗体按照不同的组合一一配对，用PBS缓冲液检测，确定最佳的C线浓度为1.5 mg/ml，T线浓度为1.2 mg/ ml。用表达的AIV-NP蛋白检测，确定最佳的金标垫喷量为35μl/ cm。

3.4 特异性

分别用试纸条检测AIV-H9、AIV-H7、AIV-H5、NDV，ALV同时用PBS缓冲液做阴性对照。结果试纸条与AIV--H9、AIV-H7、AIV-H5有良好的反应，与ALV、NDV无反应，证明试纸条具有良好的特异性。

1：H9灭活菌液；2：H7灭活菌液；3：H5灭活菌液；4：NDV灭活抗原；5：ALV表达抗原；6：PBS。

3.5 灵敏度

用原核表达的NP蛋白对试纸条进行检测，检测NP蛋白的检测下限位3×10-6mg/ml。与商业化的检测卡做比较，略高于其检测下限。

稀释倍数：1：100倍、2：1 000倍、3：10 000倍、4：100 000倍、5：1 000 000倍，6、7为空白对照。

3.6 重复性

随机选取同批次的10根试纸条以及不同批次的各10根试纸条用相同抗原检测其重复性，重复率100%。用相同方法，不同操作人进行检测，达到相同结果，证明试纸条具有稳定的重复性。

3.7 临床样本检测效果比较

用制备好的试纸条检测临床样本300份，检测结果如下表：

表1 临床样本检测结果

自制试纸条共检测83份阳性样本，分型检测H536份，H947份，阴性217份，进口试纸条检测76份阳性样本，分型检测H536份，H940份，阴性224份，阳性吻合率达91.6%，其中H5吻合率达100%，H9吻合率达85.1%。

4 讨论

在胶体金制备过程中，还原剂柠檬酸三钠对胶体金颗粒的大小起决定性作用，颗粒的大小随着用量的增加而变小。

特异性是衡量试纸条能否运用的关键因素，由于样本的复杂性，要求抗体标记金的稳定性高，尽量减少金的非特异性吸附，最后选用40 nm的金。试纸条经过金标垫，NC膜的优化，最终检测流感NP蛋白的下限为3 ng/ml。

初步应用试纸条检测临床样本，同时与某进口品牌比较，二者吻合率较高。阳性吻合率达91.6%，其中H5吻合率达100%，H9吻合率达85.1%。初步证明本试纸条可以快速、准确的检测流感病毒，能够应用于临床，为基层快速检测提供条件。

资金来源：江苏省三新工程SXGC（2013）091