PAG-ELISA 在奶牛早期妊娠诊断上的应用研究

肖胜南 张云卿 侯 婷 王 巍 薛 飞 王 瑾 杨龙峰

（北京市延庆县动物疫病预防控制中心，北京 102100）

PAG-ELISA 在奶牛早期妊娠诊断上的应用研究

肖胜南 张云卿 侯 婷 王 巍 薛 飞 王 瑾 杨龙峰*

（北京市延庆县动物疫病预防控制中心，北京 102100）

本课题研究旨在针对人工输精后的28～45 d的奶牛，分别采用PAG-ELISA方法和B超检测进行早期妊娠诊断，比较实验结果，评价PAG-ELISA检测方法对配种28～45 d的奶牛进行早期妊娠诊断的准确性。结果表明，PAG-ELISA妊娠诊断的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%，Kappa为0.952。PAG-ELSIA 检测方法和B超妊娠诊断结果符合率高，可用于母牛的早期妊娠诊断。

PAG-ELISA B超检查 早期妊娠诊断

开展精准及时的奶牛早期妊娠诊断在现代规模养殖场中对于易流产母牛的保胎、牛群的分群管理及提高繁殖效率等有着举足轻重的作用。目前，国内主要依赖B超、直肠触诊进行奶牛早期妊娠诊断，而国外奶牛养殖发达国家除了采取B超、直肠触诊进行奶牛早期妊娠诊断外，采取检测血液中妊娠相关糖蛋白（PAGELISA方法）进行奶牛早期妊娠诊断，并得到快速推广与应用。据相关资料调查，国内某些大型牧场也开始使用PAG-ELISA方法进行奶牛早期妊娠诊断，但对其临床使用效果及其影响评估资料甚是欠缺。

为了分析、利用、评估PAG-ELISA检测奶牛早期妊娠诊断的实际应用效果与影响，笔者通过B超、妊娠相关糖蛋白ELISA两种方法临床试验比较研究，于2014年1～5月对延庆县4个牛场260头配种后28～45 d的荷斯坦奶牛使用基于妊娠相关糖蛋白PAGELISA的商品化试剂盒进行早期孕检诊断，并在采集血样的同一时间开展B超妊娠诊断确认，比较分析快速PAG-ELISA的实际应用效果与影响，为PAG-ELISA 推广应用提供参考依据。

I 材料与方法

1.1 试验动物

选取配种后28～45 d的荷斯坦黑白花奶牛260头，采集静脉血液4 ml，送检实验室进行PAG-ELISA快速妊娠诊断。

1.2 试剂

牛怀孕检测试剂盒由北京爱德士元亨生物科技有限公司提供。批次04-41169-02，有效期至2014年5月31日。

1.3 PAG-ELISA方法原理

反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会释放包括PAG在内的物质到母畜血液中。PAG的浓度随着妊娠开始呈缓慢上升，直至分娩；相关研究表明，配种1个月后妊娠奶牛与非妊娠奶牛PAG浓度出现显著差异。因此，在此时检测PAG可以成为尽早诊断奶牛妊娠与否的关键指标。IDEXX牛怀孕检测试剂盒是根据酶联免疫反应原理设计的，用于检测妊娠早期存在外周循环中的PAG，通过微孔板包被纯化的PAG抗体，捕获到的外周循环中的PAG可以与特异性的纯化的PAG抗体和辣根过氧化物酶标记物结合，随后加入TMB底物溶液显色，孔内溶液的颜色深浅与样品中PAG的含量成比例，此判断妊娠与否。

1.4 IDEXX牛怀孕检测试剂盒操作步骤及结果判读

将待检奶牛血清和IDEXX 牛怀孕检测试剂盒恢复到室温，按照试剂盒说明书操作步骤进行，检测待检奶牛的妊娠状况。

阳性对照的平均值（PC）与阴性对照的平均值（NC）之差必须大于或等于0.300，另外，阴性对照的平均值（NC）必须小于或等于0.150，实验结果才有效。

具体结果诠释方法为：动物的怀孕状态是由计算每份样品的S-N值决定的。被检样品的S-N值＜0.300的，检测结果为阴性，表示此动物没有怀孕（空怀）；被检样品的S-N值≥0.300的，检测结果为阳性，表示此动物被认为是怀孕。

1.5 奶牛怀孕B超检查结果判断

经过PAG ELISA 妊娠诊断，做好相关检测结果，并在同一时间进行B超妊娠诊断确认。B超妊娠诊断未怀孕奶牛为空怀牛，若怀孕诊断为妊娠牛。

1.6 结果分析

在结果判定中，特异性为空怀牛样品中PAG检测结果为阴性的比例；敏感性为妊娠牛样品中PAG酶联免疫法检测结果为阳性的比例；结果的阴性预测值为PAG检测为空怀的牛确定为真实为空怀的比例；结果的阳性预测值为PAG检测为已孕的牛确定为真实妊娠的比例；结果的准确性为PAG检测的妊娠状况（妊娠+空怀）与B超诊断结果一致的比例。

1.7 统计与分析指标

利用Kappa值对怀孕相关蛋白PAG-ELISA 同B超诊断结果进行一致性评价。Kappa值为1表明完全符合，0为完全不符。在比较性试验中，Kappa值在0.4～0.5之间，说明符合率中等；0.5～0.6说明符合率良好；大于0.6说明符合率很高。

2 结果与分析

在试验期间，对260头奶牛分别使用B超检查（配种后28～45 d）和PAG-ELISA试剂盒2种方法进行妊娠诊断，对获得的结果进行比对分析。检测结果：利用PAG ELISA试剂盒共检测出69头奶牛阴性（空怀），191头奶牛阳性（怀孕）。在用B超检查时发现，使用PAG ELISA试剂盒检测为阴性（空怀）的69头牛全部为空怀。

PAG-ELISA 检测为阳性（怀孕）的191头牛中，用 B超检查时发现其中的186头已孕，而5头为空怀。为了分析PAG ELISA试剂盒检测结果的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性，建立了2×2列联表（见表1），并在表2中列出了以B超为标准，评估PAG ELISA试剂盒的准确性。

从表1可以得出，PAG ELISA试剂盒妊娠诊断的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为93.2%、100%、100%、97.4% 和98.1%，Kappa为0.952。PAG ELSIA 试剂盒和B超妊娠诊断结果符合率极高

为了解PAG-ELISA 妊娠诊断结果的特异性①、敏感性②、阴性预测值③、阳性预测值④和准确性⑤的2×2列联表评估表（N＝260），详见表1。

表1 PAG-ELISA 妊娠诊断和B超妊娠诊断情况比较

人工配种后通过B超诊断评价PAG-ELISA方法的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性，结果详见表2。

表2 B超评价PAG-ELISA方法的结果统计

本研究结果表明：两种妊娠诊断方法的一致率=（a+d）/ N*100=（186+69）/260=0.981。表1数据代入Kappa方程，Kappa值为0.952，分析得出，本试验表明PAG ELISA方法和B超诊断两种妊娠诊断结果符合率很高，应用PAG ELISA 方法完全能够用于奶牛早期妊娠诊断。

在本研究中，PAG ELISA试剂盒检测母牛妊娠诊断的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值和准确性分别为93.2、100、100、97.4 和98.1，与B超诊断结果相同，表明该方法可用于奶牛的早期妊娠诊断。Silva等评估PAG判断妊娠状况准确性试验中得出，PAG检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96.8%～98.9%、91.7%～97.3%、89.7%～93.8%、97.5%～99.5% 和93.9%～97.8%，本研究与Silva等的研究一致。数据表明采用PAG ELISA试剂盒检测奶牛早期妊娠诊断的敏感性和阴性预测值均很高，便于筛查空怀牛，利于让技术员查找原因，尽早采取相关措施，如病原性开展治疗、健康的准备再次配种，以缩短产犊间隔，提高牧场的生产效益。

3 讨论

据资料调查，扬州大学动物科学与技术学院贾国慧、王杏龙、王亮等在《奶牛B超妊娠诊断应用研究》的比较实验中，B超在奶牛配种后29～60 d诊断准确率均为100%，故本实验选择在28～45 d期间采用PAG-ELISA 与B超同一时间进行妊娠诊断，在保证时间的统一下也保证B超检测结果的准确性。阳性预测值没有达到100%，这可能是在奶牛怀孕早期，胚胎早期死亡，用B超检测不到胚胎，检测结果为阴性，但是血液中PAGs蛋白还是在会在母牛体内存在及循环一段时间，从而导致PAG-ELISA检测出现假阴性现象。基于在本次研究课题中阴性预测值100%，未出现假阳性，这一检测指标对牧场的繁殖管理至关重要，繁育人员不会错误的为已妊娠牛只进行再次配种处理，造成妊娠奶牛流产。

通过B超与PAG ELISA检测方法的比较研究，PAG-ELISA检测方法是可靠的、准确的。尤其适用于大型牧场，这对牧场的进一步标准化，规范化管理，提高生产养殖效益有着不可低估的作用；相关地区部门也可用此诊断方法，适当收取检测费用，组织当地牧场采用PAG ELISA方法开展奶牛早期妊娠诊断，这对提升当地奶牛养殖技术水平，提高牧场养殖生产效益有很大的促进作用。

4 存在的问题及展望

近年来，应用PAG-ELISA方法来进行奶牛早期妊娠诊断取得了很大的进步，但还存在着一些局限性。一是该方法进行奶牛早期妊娠诊断需要配备相关的检测设备，一般奶牛场无法独立完成，需要送检相关实验室开展检测。二是对配种28d以内奶牛妊娠诊断的准确性有待进一步提高；三是检测成本费用高，据调查，国内还未研发相关成熟产品，均采用进口检测试剂盒，检测成本高，检测费用在40～50元一头。

参考最新放射免疫和酶联免疫等技术的发展趋势，随着检测技术的不断发展与更新，检测血清中PAG的检测方法也将更简便，检测结果也将更准确，检测成本将会更低廉，检测PAG方法大范围推广应用，替代直肠检测、黄体酮检测、B超等传统早期妊娠诊断方法将会成为现实，这将推动奶牛业发展到一个新的生产水平。

[1] 李艳艳，胡建宏，雷静，等.牛妊娠相关糖蛋白ELISA对早期妊娠诊断效果的影响[J].家畜生态学报，2Ol3，34（3）：54-57.

[2] 贾国慧，王杏龙，王亮，等.奶牛B超妊娠诊断应用研究[J].上海畜牧兽医通讯，2009，（1）：8-9.

[3] 钟旭，薛立群，田见晖，等.妊娠相关糖蛋白（PAG）在奶牛早期妊娠诊断上的应用现状[J].中国畜牧兽，2Ol1，38（11）：140-143.

得到现代奶牛产业技术体系北京市创新团队，2013年国家自然科学基金项目（71373025），2010年教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-10-009资助）。

肖胜南（1981-），研究生，研究方向：动物疫病诊断与畜牧技术推广。

杨龙峰（1976-），男，研究生，研究方向：动物疫病防制及畜牧技术推广。