强力霉素增强胃癌细胞化疗敏感性的研究

2015-03-11赵然王学哲李红王鹏

中国现代药物应用 2015年23期

赵然王学哲李红王鹏

强力霉素增强胃癌细胞化疗敏感性的研究

赵然王学哲李红王鹏

目的探讨强力霉素(doxycycline, DOXY)对胃癌细胞BGC823化疗药物敏感性的影响及其作用机制。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对细胞的增殖抑制作用, 流式细胞法检测细胞凋亡率并检测细胞内的活性氧含量；Western blot法分别检测蛋白激酶(AKT1)/NF-kappaB/Notch1水平的表达变化。结果与DOXY和阿霉素(ADR)单独用药组比较, 两药联合用药可提高ADR对胃癌BGC823细胞的增殖抑制率﹑诱导其细胞凋亡﹑增加活性氧的含量, 上调AKT1/NF-kappaB/Notch1的表达。结论DOXY 能够增强胃癌BGC823细胞化疗敏感性, 其机制可能与增加活性氧的含量, 上调AKT1/NF-kappaB/Notch1的表达有关。

强力霉素；胃癌；化疗增敏；蛋白激酶

肿瘤细胞对化疗敏感性的高低是评价化疗在肿瘤治疗中是否成功的关键因素。增加化疗敏感性的方法多为加大药物剂量和联合用药。但是随着有效的抗增殖剂如ADR用药剂量的增大, 在提高疗效的同时对正常组织的毒性也会相应增加, 且长期应用易产生耐药性［1-3］。因此, 寻求高效低毒的联合用药治疗方案是肿瘤化疗领域的研究热点之一。

1 材料与方法

1.1 材料 DOXY购于Sigma公司, ADR购于山东普德药业有限公司, 胰蛋白酶﹑RPMI-1640 培养基﹑胎牛血清(FBS)﹑青链霉素购于Gibco公司；PTEN, Notch1, AKT1, β-actin抗体购于Santa cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔第二抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司；DCFDA 购于Sigma公司, 胃癌BGC823细胞, 北京大学人民医院郁卫东老师惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理复苏的胃癌细胞BGC823胃癌细胞系BGC823加入含有10%小牛血清的RPMI 1640 培养液中, 37℃,饱和湿度, 5%CO2培养箱中培养, 隔日换液。实验组分别加用不同浓度的药物, 每孔终体积为150 μl, 对照组加入等体积RPMI 1640 培养基, 设3个复孔。

1.2.2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率实验分以下 4 组：①空白组；②DOXY组(20 μg/ml)；③ADR组(10 μg/ml)；④DOXY+ADR组(5/10 μg/ml)。各组细胞于培养 36 h 时进行收集, 用PBS洗涤 2 次, 预冷的70%乙醇固定过夜, 再经PBS 洗涤 2 次, 离心, 加入含有 100 μg/ml RNA 酶和 50 μg/ml PI的混合液 1 ml, 重新悬浮细胞, 室温避光孵育 20 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

1.2.3 MTT 法检测各组细胞增殖抑制率各组分别于培养24﹑48﹑72 h, 采用 MTT 法检测细胞增殖抑制率。DOXY 增敏倍数 = IC50(DDP)/ IC50(DDP + DOXY)。

1.3 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用 χ2检验。多组间比较用单向方差分析(One-wayANOVA)。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT结果显示, 呈剂量-时间依赖性。空白组24﹑48﹑72 h剂量为0；ADR组分别为(0.71±0.04)ug/ml﹑(0.95±0.15)ug/ml﹑(1.46±0.32)ug/ml；DOXY组分别为(0.97±0.06)ug/ml﹑(1.76± 0.35)ug/ml﹑(1.92±0.43)ug/ml；DOXY+ADR组分别为(1.11± 0.10)ug/ml﹑(2.03±0.45)ug/ml﹑(2.48±0.54)ug/ml。各浓度组细胞增殖抑制率与相同浓度作用下, 不同作用时间的细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 流式细胞仪检测结果发现：DOXY﹑ADR和DOXY+ ADR组分别为：(16.8±1.2)﹑(19.0±1.3)﹑(24.1±1.6), 而空白组则为(4.9±1.3), 差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 实验显示, ADR组作用于BGC823细胞后, 增加的活性氧浓度(132.8±12.9)大于单独使用DOXY组(118.3±9.4), DOXY+ADR组活性氧浓度(157.5±10.4)含量明显增加, 与空白组(87.9±11.2)相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 ADR作用于胃癌 BGC823 细胞后, 增加了AKT1蛋白的表达, 通过表达上调NF-kappaB, 进而激活下游基因Notch1蛋白的表达, 从而达到促进肿瘤细胞凋亡的目的。见表1。

表1 四组的蛋白表达情况对比(±s)

组别 AKT1 NF-kappaB Notch1空白组 0.69±0.05 0.52±0.04 0.33±0.02 DOXY组 1.78±0.17 0.82±0.11 0.56±0.03 ADR组 2.01±0.23 1.28±0.15 0.61±0.03 DOXY+ADR组 2.34±0.25 1.68±0.21 0.78±0.02