荧光定量PCR检测miRNA-155在过敏性皮肤病中的应用研究

李　迎,毕连红,宋玉国

(北华大学附属医院，吉林 吉林132011)

荧光定量PCR检测miRNA-155在过敏性皮肤病中的应用研究

李迎,毕连红,宋玉国*

(北华大学附属医院，吉林 吉林132011)

摘要：目的建立荧光定量PCR技术检测外周血miRNA-155相对含量检测方法，研究过敏性皮肤病患者外周血miRNA-155表达量与正常对照组的差异。方法利用miRNA分离纯化盒提取外周血血浆中的miRNA，逆转录合成cDNA后，采用SYBR Green荧光染料法进行定量PCR检测40例荨麻疹患者、30例皮肤湿疹患者和30例健康对照组外周血中miRNA-155的表达含量。结果荨麻疹患者外周血中的miRNA-155的表达水平明显高于正常对照组((P<0.01)，也高于皮肤湿疹患者(P<0.05)；皮肤湿疹患者与正常对照组比较miRNA-155的表达水平无明显差异(P>0.05)。结论荧光定量PCR技术检测外周血miRNA-155相对含量有助于荨麻疹的诊断，为进一步研究荨麻疹的发病机制奠定实验基础。

关键词：荨麻疹；微小RNA；荧光定量PCR

(ChinJLabDiagn,2015,19:2036)

microRNAs(miRNAs)是一类由高等真核生物基因组编码的微小RNA。miRNA不能翻译成蛋白质，但有调控基因的功能[1]。miRNA具有庞大的数量，在人体内就已经发现1000种以上的miRNA，绝大多数参与正常的生理调节，少数参与疾病的发生发展过程。miR-155 是免疫系统最重要的miRNA 之一，在固有免疫应答[2]、适应性免疫应答[3，4]以及炎症性疾病[5]中均发挥重要作用。miRNA的检测方法较多，应用荧光定量PCR方法检测血浆中miRNA是一种准确、快速的方法，且可达到定量目的。本文应用该方法定量检测miRNA-155，并研究其在过敏性皮肤病中的应用价值。

1资料与方法

1.1研究对象

病例选自2014年1月至2015年4月期间，北华大学附属医院皮肤科就医患者。其中荨麻疹患者40例，男16例，女24例，年龄37.80±9.67岁；皮肤湿疹患者30例，男13例，女17例，年龄41.20±15.37岁。健康对照组选自北华大学附属医院体检中心，共30例，男15例，女15例，年龄36.47±9.87岁，近期无明显皮肤病及过敏性疾病。

1.2标本采集

清晨空腹采集静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝。常温下离心，3 500 r/min,10 min。分离血浆检测，不能及时检测的血浆标本置-70℃冰箱保存，一周内检测完毕。

1.3方法

1.3.1miRcute miRNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。按试剂盒说明操作。

1.3.2miRNA 3＇末端进行加Ploy(A)尾 剂盒由北京天根生化科技有限公司提供，反应液组成见表1。

表1　Poly(A)加尾处理反应液体系

注：混匀，12 000 rpm离心30 s,37℃ 60 min

1.3.3cDNA合成按如下20 μl反应体系配置见表2。

表2　合成cDNA反应液体系

注：同上。

1.3.4实时荧光定量PCR检测miRNA-155。PCR体系见表3。PCR条件：94℃预变性2 min；94℃30 s，60℃34 s，共45个循环；荧光采集点设在60℃34 s末。PCR结束后，以0.05℃/sec的速度开始升温，直到升高至94℃，做熔解曲线分析。

表3　PCR反应液体系

1.4统计学分析

PCR可以检测记录每个反应管中每次循环所产生的荧光信号，将每次检测到的荧光信号绘制成每个反应管的扩增曲线，当荧光强度达到一定阈值时，PCR仪记录下此时的循环数，以此为基础可以得到每个样本的Ct值。采用相对定量法进行分析，以U6作为内参照，计算标本中miRNA-155的相对表达量。标本中的miRNA相对表达量的计算公式：RQ=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。所得到的结果使用SPSS19.0软件对所得结果进行分析，各组间的比较采用两样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1PCR扩增曲线

图1为miRNA-155的扩增曲线图，曲线分为：荧光背景信号阶段、指数扩增阶段和平台期。曲线为平滑的S型，说明操作准确，结果可信。

图1　miRNA-155的扩增曲线图

2.2熔解曲线分析

在以SYBR为染料的PCR反应中，只要有双链形成就会产生荧光。由于无法判断PCR产生的荧光是否为特异性产物所发出的荧光，所以在反应结束后需进行熔解曲线的分析。如图2所示，熔解曲线图仅有单一峰，而未出现多峰，表明扩增的目的基因为单一产物，未出现非特异性扩增，实验结果可信。

图2　熔解曲线

2.3各实验组miRNA-155检测结果分析

以U6作为内参照，标本中的miRNA相对表达量按公式：RQ=2-△Ct计算，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。相对表达量取对数后进行统计分析，结果见表4。

表4　三组miRNA-155相对表达量统计表

①与湿疹组比较，P<0.05；②与正常对照组比较，P<0.01；③与正常对照组比较，P>0.05

3讨论

miRNA是单链小RNA，虽然不能翻译成蛋白质，但是可以在转录后水平对蛋白质编码基因的表达进行调控。在细胞的增殖、分化、信号转导以及器官的发育过程中均可发挥重要作用[6,7]。随着研究的不断深入，发现miRNA与过敏性疾病的发病机制密切相关。Sonkoly[8]对皮肤免疫性疾病相关的miRNA进行筛选，在初步筛选出来的29个miRNA分子中挑选出miR-203、miR-146a、miR-21及miR-125b进行扩大样本量的检测，最终证实了miR-203在银屑病患者皮损中表达水平升高并且与健康对照组及过敏组比较均有统计学意义。在众多miRNA当中，miR-155 是免疫系统最主要的miRNA 之一，在活化的各种免疫细胞中表达普遍升高，广泛参与固有免疫应答和适应性免疫应答。过敏性皮肤病是临床上常见的免疫相关性疾病，miR-155在过敏性皮肤病的发生发展中的作用如何，是近年的研究热点。2010年，Sonkoly[9]等又发表了一篇关于miR-155在荨麻疹中的表达特征的文章，研究结果证实miR-155在荨麻疹患者中的表达与对照组相比显著升高并有统计学意义。本文应用实时荧光PCR技术定量检测过敏性皮肤病中的和湿疹患者血浆中miRNA-155的相对表达量，以健康人作为对照组，研究miRNA-155检测在过敏性皮肤病中的应用价值。在应用实时荧光PCR技术定量检测miRNA-155的方法学研究中，通过全面评估PCR扩增曲线和熔解曲线，证实检测结果准确，PCR产物特异。临床应用研究结果证实，荨麻疹和湿疹患者血浆中miRNA-155的相对表达量均显著高于对照组，此结果与Sonkoly[9]报道的结果一致。本文研究结果还发现，荨麻疹组血浆中miRNA-155的相对表达量高于湿疹患者组，此结果的临床意义尚需扩大量进一步研究。

参考文献：

[1]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP．Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]．Cell，2005，120(1):15.

[2]O’Connell RM，Taganov KD，Boldin MP，et al．MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104( 5):1604．

[3]Thai TH，Calado DP，Casola S，et al．Regulation of the germinal center response by microRNA-155[J]．Science，2007，316( 5824):604．

[4]Teng G，Hakimpour P，Landgraf P，et al．MicroRNA-155 is a negative regulator of activation-induced cytidine deaminase[J]．Immunity，2008，28(5):621．

[5]Xiao B，Liu Z，Li BS，et al．Induction of microRNA-155 during Helicobacter pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory response[J]．J Infect Dis，2009，200(6):916．

[6]He L,Hannon GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet,2004,5(7):522.

[7]Miska EA.How microRNAs control cell ivision,differentiation and death[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15(5):563.

[8]Sonkoly E，Wei T，Janson PC，et al．MicroRNAs：novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis[J].PLoS One，2007，2(7)：e610．

[9]Sonkoly E,Janson P,Majuri ML，et al．MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126(3):581.

Application of miRNA-155 Detection with Fluorescence Quantitative PCR Technique in Allergic DermatosisLIYing，BILian-hongSONGYu-guo.(BeihuaUniversityAffiliatedHospital,Jilin132011，China)

Abstract:ObjectiveTo use Fluorescence Quantitative PCR technique to detect the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood,and study the differences of the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood between allergic dermatosis patients and normal controls.MethodsUse miRNA separation and purification box to extract miRNA from peripheral blood plasma,after reverse transcription of cDNA,use SYBR Green method to carry on the quantitative PCR test to detect the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood among 40 cases of urticaria patients,30 cases of eczema patients and 30 cases of healthy controls.ResultsThe expression level of miRNA-155 in peripheral blood of urticaria patients was significantly higher than that of the control group (P<0.01) and was also higher than that of eczema patients (P<0.05).There is no significant difference of the miRNA-155 expression level between eczema patients and normal control group (P>0.05).ConclusionThe detection of the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood with Fluorescence Quantitative PCR technique is conductive to the diagnosis of urticaria,laying an experimental foundation for further study of the pathogenesis of urticaria.

Key words:urticaria;miRNA;fluorescence quantitative PCR

(收稿日期：2015-05-14)

文献标识码：A

中图分类号：R758.2

文章编号：1007-4287(2015)12-2036-03

*通讯作者

基金项目:吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(201339022)