偶氮染料降解氧化产物苯胺的液相色谱/质谱联用法测定

李志刚

(浙江工业职业技术学院，浙江 绍兴 312000)

偶氮染料降解氧化产物苯胺的液相色谱/质谱联用法测定

李志刚

(浙江工业职业技术学院，浙江 绍兴 312000)

采用液相色谱/质谱联用法测定由Fenton法降解含偶氮染料的印染废水中的痕量苯胺。降解反应溶液中的苯胺通过HLB固相萃取小柱净化、富集后，在XR-ODS II柱上，以乙腈/5mmol/L乙酸铵+0.05%甲酸为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾(ESI)电离正离子多反应监测模式(MRM)测定。结果表明，实验采用的固相萃取小柱能有效地去除溶液中的Fe2+和干扰苯胺测定的化合物，苯胺在10.0～1000.0 μg/L范围内具有良好的线性，相关系数为0.9993，回收率在93.0% ～98.8% 范围，日内相对标准偏差(RSDs)在3.2% ～6.9%之间，日间RSDs在4.8% ～6.3%之间，最低定量检出限为2.0 μg/L。建立的方法简便、干扰少、特异性强，应用此法测定Fenton反应液中的痕量苯胺取得了满意的结果。

偶氮染料;氧化产物;苯胺;液相色谱-质谱法

Fenton法以其设备简单，能量消耗少，运行成本低，工艺安全稳定等特点目前已被广泛用于有毒、有害、难生物降解等印染废水的处理中，但是在利用Fenton法进行印染废水处理前，需要对其降解机制及工艺优化进行系列研究。苯胺作为偶氮染料的一种重要降解产物，对Fenton法降解机制和降解途径的阐释及工艺条件的优化起到非常关键的作用，而苯胺是一种可经皮肤吸收易引起慢性、急性中毒的具有中等毒性的化合物［1－3］，因此，在利用 Fenton法处理偶氮染料时，监测溶液中降解产生的痕量苯胺显得十分重要。

有关苯胺的检测方法目前国内外的文献报道有:萘乙二胺偶氮分光光度法［4］、紫外液相色谱法［5］、荧光液相色谱法［6－7］、氢火焰离子气相色谱法［8－9］、示波极谱法［10］、气/质联用法［11］和液/质联用法［12］等。分光光度法和紫外液相色谱法存在灵敏度低，抗干扰能力弱等不足，难以满足Fenton法溶液中痕量苯胺监测的要求，而荧光液相色谱法、氢火焰离子气相色谱法以及示波极谱法均不能提供待测化合物的结构信息，其定性能力不甚理想。气/质联用法和液/质联用法因都具有定性能力强和检测灵敏度高等优点得到广泛应用，特别是针对复杂基体中痕量有机物的定性定量测定，但在本文试验中，如果采用气相色谱/质谱联用法进行检测，则需要对样品进行溶剂转换，否则会缩短色谱柱的寿命。为此，选择采用液相色谱/串联质谱法对样品进行测定。此外，考虑到经过Fenton反应后的溶液会含有较高浓度的Fe2+和其他干扰苯胺测定的化合物，采用HLB固相萃取小柱进行净化，有效除去干扰物质，获得了理想的试验结果。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

UFLC XR型超快速液相色谱仪，包括二元高压输液泵、自动进样器、柱温箱和在线脱气机(日本岛津株式会社)，配API 5500型三重四极杆串联质谱仪(美国AB SCIEX公司);Milli-Q纯水制备系统(美国Millipore公司);全玻璃溶剂过滤装置(美国Waters公司);12孔固相萃取仪(美国 Supelco公司)。

试剂苯胺(0.989 mg/mL)(中国计量科学研究院)、甲醇、乙腈均为LC/MS级(美国Fisher公司)，甲酸、氨水、乙酸铵均为 HPLC级(德国 Merck公司)。HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，美国Waters公司)。试验用水均来自Milli-Q纯水制备系统。标准中间液(10.0 mg/L):准确吸取苯胺标准溶液101.0 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释后并定容至刻度，此标准中间液的质量浓度为10.0 mg/L，于4℃冰箱中保存，备用。

1.2 色-质谱联用条件

色谱条件:色谱柱为Shim-pack XR-ODS II柱(75mm ×2.0mm，2.2μm);流动相:A 相为水(内含5mmol/L乙酸铵+0.05%甲酸)，B相为乙腈/水(体积比为90∶10)(内含5mmol/L乙酸铵+0.05%甲酸)，梯度洗脱，程序见表1。流速为150 μL/min;柱温35℃;进样体积为5.0 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

质谱条件为:离子源为电喷雾电离离子源(ESI);定量方式采用多反应监测正离子模式(MRM);GS1压力3.45×105Pa;IS电压4500 V;CUR压力1.38×105Pa;GS2流速3.45×105Pa;CAD气压4.83×104Pa;离子源温度550℃;扫描时间50 ms;EP电压10.0 V;CXP电压10.0 V;DP电压180 V;CE能量25 eV。苯胺的定量离子对m/z 94→m/z 77，定性离子对m/z 94→m/z 51。

1.3 标准系列的制备

分别吸取苯胺标准中间液(10.0 mg/L)0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用水/乙腈(体积比为90∶10)稀释并定容至刻度，配成质量浓度为 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0 μg/L的标准溶液系列。然后在选定的色-质谱条件下测定，以目标物浓度(C，μg/L)对色谱MRM峰面积(A)进行线性回归，并计算相关系数。

1.4 样品的制备

准确吸取5.0 mL的Fenton反应溶液移入事先用3 mL甲醇、3 mL去离子水活化的HLB固相萃取小柱，抽干后，用30%甲醇溶液、5%氨水、5%甲酸和去离子水各3 mL分别进行淋洗，最后用3 mL水/甲醇(体积比为1∶4)进行洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹至近干，用水/乙腈(体积比为90∶10)复溶后定容至1.0 mL，漩涡1 min，过0.2μm 的PTFE 滤膜后，进样，测定。

2 结果与讨论

2.1 色/质谱条件的选择与优化

2.1.1 流动相的优化

针对流动相，在之前所建的液相色谱紫外/荧光检测方法中，使用的是水/乙腈体系，苯胺在C18色谱柱上有较理想的色谱响应，但是此条件下苯胺的质谱响应并不理想，本文尝试在水/乙腈体系中添加乙酸铵或甲酸作为流动相改性剂来考察苯胺质谱行为。结果表明，如果单独在流动相中添加甲酸，苯胺的质谱响应会随着甲酸含量的增加(0～0.2%)而慢慢增大，但是其色谱保留时间慢慢变短，当甲酸含量达到0.2%时，苯胺几乎无保留;当继续添加5mmol/L乙酸铵进入流动相之后，流动相形成了缓冲溶液，待测物的色谱保留时间得到了改善，而其质谱响应值又随之降低。经反复试验，最终选择在流动相中添加0.05%甲酸和5mmol/L乙酸铵，在优化后的流动相条件下，苯胺的保留时间为2.7 min，而且质谱相应较高，能满足检测要求。图1示出ESI(+)苯胺的MRM色谱图。

图1 苯胺MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of aniline

2.1.2 质谱的定性确证分析

根据待测化合物的结构特点采用ESI源在正离子模式下对目标物质谱信号及稳定性进行试验。采用质谱仪的自动化程序，将质量浓度为100 μg/L的苯胺以10.0 μL/mim的速度通过蠕动泵直接引入质谱仪，观察其质谱行为。结果表明，在一级质谱时，在ESI(+)模式下产生的碎片离子其基峰为苯胺的准分子离子峰m/z 94.0［M+H］+，它可以作为目标物定性分析的主要依据之一。同时，采用串联质谱对目标化合物进行进一步的参数优化，获得其二级质谱图，见图 2。由图可知，质谱图中m/z 94.0为苯胺分子结构中的氨基与1个氢离子结合后形成的准分子离子［M+H］+，m/z 77.0为苯胺分子离子裂解脱去1个中性氨(NH3)分子后形成的碎片离子［M+H-NH3］+，而 m/z 51.0是碎片离子［M+H-NH3］+继续开环并脱去1个中性分子乙炔(C2H2)后形成的［M+H-NH3-C2H2］+。根据碎片离子的响应程度，试验选择m/z 94→m/z 77为定量离子对，m/z 94→m/z 51为定性离子对，对Fenton反应液中存在的痕量苯胺进行定性和定量测定。

图2 苯胺二级质谱图Fig.2 MS/MS spectrum of aniline

2.2 固相萃取柱的选择与优化

2.2.1 固相萃取柱的选择

由于Fenton反应后的溶液会存在较高浓度的Fe2+和干扰苯胺测定的化合物，采用固相萃取法对样品进行预处理，固相萃取具有净化能力强，浓缩倍数高等特点。根据被测化合物苯胺的化学结构性质以及样品基体的基本特性，尝试使用以聚苯乙烯-二乙烯基苯-吡咯烷酮作为填料的Oasis HLB固相萃取小柱。检测结果表明，建立的方法能获得满意的结果，具有操作简单，回收率高且稳定的优点。

2.2.2 固相萃取淋洗洗脱条件的优化

为最大程度减少基质的干扰，提高检测的灵敏度和准确度，进一步对HLB小柱的淋洗和洗脱条件进行优化，试验分别采用含20%、30%、40%、60%、80%、90%以及100%的甲醇/水溶液3.0 mL进行淋洗和洗脱。表2示出洗脱回收率与洗脱溶液的关系。由表可知，当采用20%和30%甲醇/水溶液3.0 mL进行洗脱，苯胺均未被洗脱。而当用40%甲醇/水溶液3.0 mL进行洗脱时，有少量苯胺被洗脱，随着甲醇用量的不断增加，被洗脱的苯胺越来越多，当甲醇用量达到80%时，其回收率已接近100%，为保证苯胺有较高的回收率，并能将基质干扰降至最低，采用30%甲醇/水(v/v)溶液作为淋洗液，80%甲醇/水(v/v)溶液作为洗脱剂，在此条件下对样品进行净化，可以保证苯胺既有好的回收率，又可以把基质干扰降到较低的水平，此外，试验还在淋洗步骤中添加5%甲酸和5%氨水，在确保目标化合物不损失的前提下，可以除去部分杂质。

表2 洗脱液与洗脱率的关系Tab.2 Relationship between eluate and eluting ratio%

2.3 方法线性范围和检出限

根据1.3小节中标准系列的制备，进样测定后，其典型的线性回归方程为A=4.86×103C+16.3，回归系数(r)为0.9993，线性范围为 10.0～1000.0 μg/L。苯胺的检出限(LOD)为0.6 μg/L，最低定量检出限(LOQ)为2.0 μg/L。

2.4 加标回收率试验和精密度

取不含苯胺的Fenton反应溶液若干份，分别准确加入低、中、高3个不同含量的苯胺标准溶液，使溶液中苯胺的质量浓度分别为 5.0、50.0、150.0 μg/L，按照1.4小节中的样品处理操作，每天每个浓度平行测定6次，计算其日内相对标准偏差。连续3 d，每天平行测定6次，计算其日间相对标准偏差，结果见表3。可知，苯胺的加标回收率在93.0% ～98.8%之间，日内相对标准偏差在3.2% ～6.9%之间，日间相对标准偏差在4.8% ～6.3%之间。

表3 方法的加收率和精密度(苯胺)Tab.3 Recoveries and precisions of proposed method

2.5 实际样品的降解动力学研究

利用所建方法，对Fenton反应溶液中偶氮染料降解的氧化产物苯胺进行监测，每隔30 min采集1份样本进行检测，共检测样品6份。结果表明，苯胺在Fenton反应开始后60 min达到最大值36.2 μg/L，随后慢慢下降，苯胺在此降解过程中始终存在，但浓度较低，这主要可能是由于降解产生的苯胺很快会与溶液中的其他物质作用形成更为稳定的化合物或进一步自身降解。

3 结论

本文试验建立了一种简单、快速的检测Fenton反应溶液中偶氮染料的降解氧化产物痕量苯胺的液相色谱/串联质谱方法，建立的方法回收率高，稳定性好，可用于偶氮染料的Fenton法降解的机制及其动力学研究。

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Determination of oxidative product aniline in degradation azo dye by liquid-phase chromatography coupled with mass spectrometry

LI Zhigang
(Zhejiang Industry Polytechnic College，Shaoxing，Zhejiang 312000，China)

A method for the determination of trace aniline in degradation of printing and dyeing wastewater containing azo dye using the Fenton by liquid chromatography coupled with mass spectrometry was developed.After aniline in the Fenton's reaction solution was cleaned and enriched by the HLB cartridges，the separation was performed on an XR-ODS II column by using the mobile phase of acetonitrile，0.05%formic acid and 5mmol/L ammonium acetate solution in gradient elution.Detection was carried out by LC-MS/MS using a positive electrospray ionization interface in the multi-reaction monitoring(MRM)mode.The results show that the HLB cartridge can effectively remove Fe2+and interfering substance from the Fenton's reaction solution.Calibration curve was linear within the range of 10.0 －1000.0 μg/L with a correlation coefficient 0.9993，and the limit of quantification(LOQ)was 2.0 μg/L.The extraction recoveries were between 93.0% －98.8%，and the intra-day RSDs were of 3.2% －6.9%，and the inter-day RSDs were of 4.8% －6.3%.The developed method is simple，less in disturbance and good in specificity for the satisfactory determination of trace aniline in the Fenton degradation azo dye solution.

azo dye;oxidative product;aniline;LC-MS/MS

TS 197

A

10.13475/j.fzxb.20140401605

2014－04－04

2014－12－09

李志刚(1966—)，男，高级工程师，硕士。研究方向为染整新技术。E-mail:nblzg66@163.com。