头孢曲松钠对慢性神经病理性疼痛的影响及其机制探讨

卢丽莉，杨倩，仇艳玲，易力

(1石家庄市第三医院，石家庄050011;2石家庄市第四医院; 3河北省优抚医院)

外周神经损伤可导致神经病理性疼痛，包括痛觉过敏、痛性感觉异常、自发性疼痛。谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，参与脊髓水平伤害性信息的传递及痛觉过敏的形成;因胞外没有谷氨酸代谢酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸转运体(GLT)。目前，已克隆出5种高亲和力GLT［1，2］，其中GLT-1在病理性疼痛和痛过敏的发生和维持中发挥重要作用［3～6］。Rothstein等［7］报道，β-内酰胺类抗生素中的头孢曲松(Cef)可增加GLT-1表达和谷氨酸摄取，但其是否会对慢性神经病性疼痛过程产生影响尚未报道。2013年10月～2014年3月，我们观察了Cef对大鼠坐骨神经慢性结扎损伤(CCI)慢性神经病理性疼痛的影响，并观察脊髓后角组织中GLT-1表达的变化，为临床上病理性疼痛的防治提供新线索与思路。

1 材料与方法

1.1 分组与造模处理 健康雄性SD大鼠70只，体质量(280±20)g。将动物随机分为7组各10只，A组仅暴露坐骨神经不结扎，B～F组均行右侧CCI［8］制作慢性神经病理性疼痛模型;C、E组分别于术后第1、7天开始于腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次;D、F分别与C、E组相同，均同时腹腔注射NS。7组术前第1天，A、B、E、F组术后第1、3、5、7、9、11、14天，C、D组术后第1、3、5、7天，测定热缩足反射潜伏期、机械缩足反射阈值后，取材观察GLT-1表达。

1.2 热缩足反射潜伏期测定 应用BME-410A型热痛刺激仪(光源为12 V/35 W卤素灯)进行。测痛实验台高36 cm，顶部为2 mm厚的石英玻璃板。将有机玻璃板制成的动物笼(220 mm×220 mm× 280 mm，无底，用有机玻璃隔板隔成3个23 mm×11 mm×28 cm的独立空间)置于测痛实验台顶部的石英玻璃板上，将待测动物置于笼内;调节光源与石英玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径5 mm，从开始照射至出现缩足逃避反射的时间(s)即为热刺激缩足潜伏期。重复测量5次，同一部位间隔10 min，不同部位间隔5 min，取平均值。如＞30 s无反应，则停止照射，以免导致大鼠足底组织过热损伤。

1.3 机械缩足反射阈值测定 应用von-Frey纤维机械刺激器，包括12种刺激强度(0.09、0.18、0.28、0.52、1.12、3.80、5.50、7.70、10.40、18.20、44.00、 61.00 g)。将透明有机玻璃动物笼置于顶部为铁丝网的36 cm高的测痛实验台上，将待测大鼠置于笼中。实验者手持纤维穿过铁丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激强度由小到大，每个强度刺激10次(次与次间隔3～5 s)，将出现缩足反应5次以上的强度定为大鼠对机械刺激的反应阈值。刺激阈值刺激阈值＞61.00 g均以61.00 g计，＜0.09 g均以0.09 g计。

1.4 脊髓后角GLT-1检测 采用Western blot法。在预定时间点，将动物迅速断头处死，取出L4、L5脊髓节段，将所取标本置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h备用。取L4、L5脊髓节段，切取右侧脊髓后角;称重后加入10倍体积的预冷裂解液，在冰浴下制成匀浆。4℃ 12 000 g离心 10 min，取上清－70℃保存。采用考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量后，电泳、转膜、免疫显色;应用凝胶图像分析系统进行相对定量分析，以各处理组样本与β-actin蛋白的IOD值之比作为蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量数据用s表示，组间比较应用单因素方差分析，组内比较应用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组热缩足反射潜伏期比较 见表1。

表1 各组热缩足反射潜伏期比较(s，s)

表1 各组热缩足反射潜伏期比较(s，s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与D组比较，△P＜0.05;与F组比较，#P＜0.05。

组别 术前1 d 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后9 d 术后11 d 术后14 d A组 15.2±1.8 14.0±1.1 15.4±0.8 14.6±1.4 13.5±1.6 13.7±0.8 14.5±1.7 13.9±1.2 B组 14.0±0.9 14.2±0.7 9.5±1.4* 6.6±1.2* 7.5±1.1* 7.4±1.7* 7.2±1.0* 7.7±1.7* C组 14.4±1.2 14.6±1.1 9.2±1.0 9.6±0.5△ 12.3±1.7△ － － －D组 14.1±0.7 14.6±0.4 9.8±0.2 7.1±1.9 6.9±0.7 － － －E组 14.0±1.1 13.7±1.0 9.5±0.6 6.9±1.6 7.7±1.9 7.7±0.5 10.3±0.7# 12.1±1.0# F组 14.3±1.4 14.2±0.8 8.5±0.8 5.8±0.7 7.2±1.3 6.5±1.6 6.7±0.3 6.6±1.1

2.2 各组机械缩足反射阈值比较 各组机械缩足 反射阈值比较，见表2。

表2 各组机械缩足反射阈值比较(g，s)

表2 各组机械缩足反射阈值比较(g，s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与D组比较，△P＜0.05;与F组比较，#P＜0.05。

组别 术前1 d 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后9 d 术后11 d 术后14 d A组 42.1±14.1 38.8±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 48.5±11.5 48.5±11.5 42.1±14.1 42.1±14.1 B组 33.6±14.1 38.8±11.6 10.8±4.3* 7.6±2.9* 6.5±1.8* 7.4±2.7* 6.2±1.9* 4.8±2.0* C组 38.2±16.9 42.5±13.7 10.8±3.9 13.0±4.0 26.8±11.5△ － － －D组 35.4±14.9 26.8±14.9 15.6±4.5 8.6±1.6 7.0±1.3 － － －E组 33.7±14.1 33.7±14.1 14.3±4.5 8.4±1.4 7.2±1.1 9.1±1.5 12.0±3.9 24.7±12.9# F组 35.4±14.9 35.3±15.0 13.0±4.5 9.5±1.6 7.0±1.3 7.3±3.3 5.7±2.0 5.1±2.3

2.3 各组脊髓后角GLT-1蛋白表达比较 A组可见脊髓后角组织中GLT-1蛋白表达，CCI后脊髓后角GLT-1蛋白表达出现双向性变化;与A组相比较，B组CCI后第1、3、5天脊髓后角组织中GLT-1蛋白表达显著升高，CCI后第7、9、11、14天脊髓后角组织中GLT-1蛋白表达下降，P均＜0.05。C组CCI后第7天脊髓后角组织中GLT-1蛋白表达较D组显著升高(P＜0.05)，E组CCI后第14天脊髓后角组织中GLT-1蛋白表达较F组显著升高(P＜0.05)。见表3。

表3 各组脊髓后角GLT-1蛋白表达比较(s)

表3 各组脊髓后角GLT-1蛋白表达比较(s)

注:与A组比较，*P＜0.05;与D组比较，△P＜0.05;与F组比较，#P＜0.05。

组别 术前1 d 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后9 d 术后11 d 术后14 d A组 1.60±0.12 1.50±0.11 1.50±0.21 1.60±0.13 1.60±0.22 1.50±0.15 1.60±0.23 1.60±0.13 B组 1.50±0.21 2.20±0.13* 2.70±0.11* 3.30±0.23* 0.70±0.04* 0.50±0.02* 0.50±0.03* 0.40±0.15* C组 1.70±0.13 2.30±0.12 2.70±0.23 3.30±0.21 2.60±0.08△ － － －D组 1.60±0.14 2.20±0.21 2.60±0.13 3.20±0.17 0.60±0.03 － － －E组 1.50±0.14 2.30±0.19 2.70±0.12 3.20±0.21 0.80±0.04 0.50±0.03 0.70±0.05 3.10±0.18# F组 1.60±0.13 2.30±0.18 2.60±0.14 3.30±0.17 0.70±0.10 0.60±0.05 0.50±0.03 0.40±0.02

3 讨论

CCI模型是目前神经病理性疼痛研究中应用最广泛的模型，制作简便、稳定，能较好地模拟临床神经损伤后的痛觉过敏现象［8］。CCI模型的特点是用铬制羊肠线轻度结扎坐骨神经，使粗的有髓鞘纤维选择性的损伤，但仍保留大部分传递疼痛的C类纤维。模型动物术后第3天开始出现痛觉过敏，第5～7天降到最低，痛觉异常状态可持续2～3个月。本实验观察到，CCI大鼠术后第1天在坐骨神经压迫侧即可见足趾部卷曲、足外翻、跋行，行走时着地时间明显缩短，足部边缘着地，有明显的后肢保护现象出现。术后第3天，坐骨神经压迫侧出现痛觉过敏现象，热缩足反射潜伏期和械缩足反射阈值开始降低，到术后第5～7天达最低值，持续到所测试的第14天。这些变化同文献报道一致［8］。本研究还发现，CCI大鼠CCI侧脊髓后角GLT-1表达出现双向性变化，术后第1、4天表达明显升高，第7、14天表达减少。GLT后期阶段的下调同与CCI大鼠热缩足反射潜伏期和械缩足反射阈值降低相一致，因此推测GLT-1对CCI导致的慢性神经病理性疼痛的产生和维持具有重要作用。

最近研究发现［7］，15种β-内酰胺类抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有出人意料的新功能，其中Cef可通过血脑屏障进入脑和脊髓。连续腹腔注射Cef 6～7 d后，可以选择性地诱发编码GLT-1谷氨酸转运体的基因转录，增加GLT-1的脑内表达，并增强其功能活性。本实验在CCI术后第1、7腹腔注射Cef，注射7 d后大鼠的热刺激潜伏期和机械缩足潜伏期明显延长，且CCI侧脊髓后角GLT-1表达明显增加。表明Cef可通过激动GLT-1对疼痛起到预防和治疗作用。

CCI导致的神经损伤诱导了脊髓谷氨酸的释放及GLT的过度激活，最初GLT的上调为一种保护性的机制［9］，摄取突触间隙的谷氨酸，减少这种过度激活导致的有害影响。尽管GLT的最初上调不能完全阻止神经病理性痛的发展，但是在阻碍慢性病理性疼痛发展方面发挥了重要作用［10］。有研究表明，神经损伤后反馈性GLT上调，Trk受体和MAPK也发挥了积极的作用［11］;后期GLT下调，可能是由于失去了初级传入引起的，而且脊髓中的退化性变化也部分导致脊髓胶质细胞型GLT的下调。脊髓GLT表达减少可致脊髓谷氨酸蓄积［12］，使谷氨酸受体过度的激活，产生自发性痛和痛觉过敏。本研究应用Cef激动GLT-1表达后，抑制了CCI后期脊髓GLT表达的下降，使脊髓细胞间隙谷氨酸不会造成慢性蓄积，从而减轻了热痛敏和机械痛敏的产生;为临床上预防和治疗慢性神经病理性体提供了新的依据与思路。

［1］Ye Z，Sontheimer H.Modulation of glial glutamate transport through cell interactions with the extracellular matrix［J］.Int J Dev Neurosci，2002，20(3-5):209.

［2］O'Shea R.Roles and regulation of glutamate transporters in the central nervous system［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2002 (29):1018-1023.

［3］Sung B，Lim G，Mao J.Altered expression and uptake activity of spinal glutamate transporters following peripheral nerve injury contributes to the pathogenesis of neuropathic pain in rats［J］.J Neurosci，2003，23(7):2899-2910.

［4］Minami T，Matsumura S，Okuda-Ashitaka E，et al.Characterization of the glutamatergic system for induction and maintenance of allodynia［J］.Brain Res，2001，895(1-2):178-185.

［5］Niederberger E，Schmidtko A，Rothstein JD，et al.Modulation of spinal nociceptive processing through the glutamate transporter GLT-1［J］.Neuroscience，2003，116(1):81-87.

［6］Gosselina RD，Damien B，Isabelle D.Upregulation of the GABA transporter GLT-1 in the gracile nucleus in the spared nerve injury model of neuropathic pain［J］.Neurosci Lett，2010，480(2):132-137.

［7］Rothstein JD，Patel S，Regan MR，et al.β-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression［J］.Nature，2005，433(7021):73-77.

［8］Bennett GJ and Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat thatproduces disorder of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33(1):87-107.

［9］Mao QX，Yang TD.Amitriptyline upregulates EAAT1 and EAAT2 in neuropathic pain rats［J］.Brain Res Bull，2010，81(4-5):424-427.

［10］Napier IA，Moharnmadi SA，Christie MJ.Glutamate transporter dysfunction associated with nerve injury-induced pain in mice［J］.J Neurophysiol，2012，107(2):649-657.

［11］Danbolt NC.Glutamate uptake［J］.Prog Neurol，2001，65(1):1-105.

［12］杨娜，隋峰，姜廷良.神经性疾病相关的谷氨酸转运体研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(7):255-258.