中药单体绿原酸对深静脉血栓形成大鼠Th17/Treg亚群失衡的影响

孙涛，李霞，王彬

(1山东省医学科学院基础医学研究所，济南250062;2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院;3济宁医学院基础学院;4山东中医药大学附属医院)

深静脉血栓形成(DVT)是常见的周围血管疾病，急性期易并发致死性肺栓塞。T细胞不同亚群产生不同的细胞因子形成复杂的细胞因子网络，发挥核心免疫调节作用。调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)，其分化、发育调节机制不同于Th1、Th2，在抑制过度的免疫应答和促进免疫炎症性反应过程中处于关键地位，且与流产后异常子宫出血及DVT发生、发展关系密切［1～3］。我们在前期研究中发现，DVT患者存在Th17型细胞因子表达升高，Th17/Treg亚群失衡参与了DVT的发生与发展［4］。绿原酸是茵陈、金银花等中药的主要有效成分，具有抗氧化作用及免疫调节等作用［5］。2013年6月～2014年3月，我们观察了中药单体绿原酸干预后DVT大鼠Th17、Treg亚群分化状态及其特征性细胞因子(IL-17、TGF-β)的表达变化，阐释绿原酸逆转Th17/Treg亚群失衡治疗DVT的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 Wistar大鼠60只，12周龄，体质量200～250 g，雄性，SPF级，购自山东大学实验动物中心(许可证号SCXK鲁20090001);自由饮水和摄食，室温25～26℃，相对湿度45%左右;定期紫外线室内消毒，适应性饲养7 d。中药单体原料药绿原酸(南京海陵中药制药工艺技术国家工程研究中心，纯度95.0%;批号060801)，生理盐水由山东华鲁制药有限公司生产，批准文号国药准字H37022750;大鼠抗小鼠荧光抗体FITC-CD4购自美国BD Pharmigen公司，IL-17、TGF-β ELISA试剂盒购自美国BD R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将60只大鼠随机分为6组各10只，A、B、C、D组根据Reyers法建立大鼠DVT模型，分别给予绿原酸40、20、10 mg/kg及等量生理盐水连续灌胃7 d，自由饮水摄食。E组麻醉后分离下腔静脉但不予结扎，直接缝合腹膜、皮肤，术后给予生理盐水连续灌胃7 d。F组不处理，给予生理盐水连续灌胃7 d。

1.2.2 Th17、Treg亚群检测 末次药物处理后次日，大鼠心脏取血，分离血清。无菌分离大鼠脾脏，针栓研磨制成单细胞悬液;200目铜网过滤，调整细胞浓度为1×106/mL，加入佛波酯30 μg/L、离子霉素1 mg/L、莫能霉素1.7 μg/L，37℃，5%CO2孵育4 h。收集细胞，1×PBS洗2遍，去上清，加入小鼠血清，室温避光孵育30 min。将外标抗体FITC-CD4按说明书加入到细胞悬液中，4℃避光孵育30 min。1×PBS洗2遍，去上清。BD固定穿膜试剂盒固定穿膜(按说明书操作)，加入内标抗体(PE-IL-17、PETGF-β)，4℃避光孵育30 min;穿膜缓冲液洗2次，去上清，PBS重悬细胞，转管，上机检测。Winmidin 2.9分析Th17及Treg亚群比例。

1.2.3 血清IL-17、TGF-β检测 采用ELISA法检测血清Th17型细胞因子IL-17及Treg型细胞因子TGF-β蛋白表达，按照试剂盒说明操作，每个标本设3个复孔。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以s表示，组间比较用One Way-ANOVA方差分析，两组间比较采用Turkey法检验;数据间相关性用Pearson相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Th17、Treg亚群比例及比值比较 见表1。

表1 各组Th17/Treg亚群比例及比值比较(s)

表1 各组Th17/Treg亚群比例及比值比较(s)

注:与F组比较，aP＜0.05;与E组比较，bP＜0.05;与D组比较，cP＜0.05;与C组比较，dP＜0.05;与B组比较，eP＜0.05。

组别 n Th17亚群(%)Treg亚群(%)Th17/Treg A组 10 11.27±0.68cde 4.43±0.17cde 2.87±0.34cde B组 10 13.45±0.71abcd 4.08±0.16abcd 3.30±0.28abcd C组 10 16.62±0.70abce 3.82±0.18abce 4.32±0.36abce D组 10 18.43±0.84abde 3.06±0.15abde 5.88±0.41abde E组 10 11.48±0.67cde 4.36±0.22cde 2.92±0.26cde F组 10 11.02±0.72cde 4.52±0.19cde 2.71±0.26cde

2.2 各组血清IL-17、TGF-β水平比较 见表2。

表2 各组血清IL-17、TGF-β水平比较(ng/mL，s)

表2 各组血清IL-17、TGF-β水平比较(ng/mL，s)

注:与F组比较，aP＜0.05;与E组比较，bP＜0.05;与D组比较，cP＜0.05;与C组比较，dP＜0.05;与B组比较，eP＜0.05。

组别 n IL-17 TGF-β A组 10 92.44±6.14cde 45.68±3.65cde B组 10 101.25±5.66abcd 41.40±3.52abcd C组 10 114.02±6.53abe 36.88±2.76abe D组 10 117.60±7.05abe 34.52±3.04abe E组 10 94.87±6.24cde 44.04±2.83cde F组 10 89.90±5.65cde 46.62±3.23cde

2.3 Th17/Treg值与血清IL-17、TGF-β的关系 相关性分析显示，Th17/Treg值与IL-17呈正相关(r= 0.618，P＜0.05)，与TGF-β呈负相关(r=－0.577，P＜0.05)。

3 讨论

T细胞是机体免疫调节的主体细胞，在抵御外界病原体感染及维持机体内环境稳定中发挥着重要作用。初始T细胞受抗原刺激后，在分化诱导因子及特异性核转录因子作用下分化为不同的亚群，产生特异性细胞因子，主导不同的免疫反应。T细胞经IFN-γ和IL-12诱导分化为Th17亚群，分泌IL-17等细胞因子;IL-2通过诱导T-bet的表达和上调IL-12R β2亚基促进Th17细胞分化，同时它还刺激NK细胞、巨噬细胞的活化生长和增强它们的杀伤能力，加重炎症反应，参与多种自身免疫疾病［6，7］。初始T细胞经IL-4诱导分化成Treg亚群，分泌TGF-β等细胞因子，激活B细胞，介导体液免疫，能拮抗性抑制Th17型细胞因子介导的炎症反应，使机体的免疫应答限制在适度范围，避免过强的炎症反应导致的组织损伤［8，9］。

Th17细胞和Treg细胞具有共同的起源，相互构成复杂的作用。Th17/Treg亚群相互调节，在生理状态下处于免疫动态平衡之中，维持机体正常免疫功能及自稳状态［10，11］，二者比例在某种程度上能够反映机体免疫系统是处于调控状态还是炎症状态［12，13］。Th17细胞和Treg细胞之间平衡状态的打破，可能是很多炎症性疾病及自身免疫性疾病发生、发展的一个关键因素。

绿原酸是中药茵陈的主要有效单体成分。大量的实验证明，绿原酸是一种自由基清除剂及抗氧化剂。它通过清除氧自由基及抗脂质过氧化，可保护血管内皮细胞，进而对心血管系统产生有效的保护作用。药理研究证实，绿原酸对免疫功能具有调节作用，可以通过抑制炎症反应，改善静脉内皮功能［14，15］。

本研究发现，在DVT模型大鼠Th17亚群比例明显升高，Treg亚群比例明显降低，Th17型细胞因子占主导地位。提示Th17/Treg亚群失衡参与了DVT形成过程。绿原酸治疗后，DVT大鼠Th17亚群比例及其特征性因子表达显著降低，Treg亚群比例及抑炎因子表达显著升高。证实中药单体通过优势诱导Treg亚群分化，逆转Th17/Treg亚群失衡，减少Th17型炎性细胞因子分泌，进而减轻炎症反应对血管内皮的损伤，抑制血栓形成。经过相关性分析，我们观察到 Th17/Treg值与 IL-17呈正相关，与TGF-β呈负相关。

本研究证实，Th17/Treg亚群失衡参与了DVT形成过程，中药单体通过逆转Th17/Treg亚群失衡，减轻炎症反应，进而保护血管内皮细胞，发挥治疗DVT的作用。但是，DVT中Th17/Treg亚群失衡的根源及中药单体调节Th17/Treg亚群偏移的分子机制，仍需进一步深入探讨。

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