辛伐他汀和阿托伐他汀对人结肠癌和肺癌细胞株作用的探究*

谢亚磊贺巾钊李琼朱玲△(.四川大学华西基础医学与法医学院0级基础医学国家基地班,四川成都 6004; .四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室,四川成都 6004)

辛伐他汀和阿托伐他汀对人结肠癌和肺癌细胞株作用的探究*

谢亚磊1贺巾钊1李琼2朱玲2△
(1.四川大学华西基础医学与法医学院2011级基础医学国家基地班,四川成都 610041; 2.四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室,四川成都 610041)

摘要目的:初步探究他汀类药物对人结肠癌和肺癌细胞株的毒性作用。方法:以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)对结肠癌细胞株HCT116、肺癌细胞株A549的细胞毒作用,计算两种药物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。结果:SV、AV对HCT116的IC50分别为42.992μmol·L-1、47.845μmol·L-1,SV、AV对A549的IC50分别为41.50μmol·L-1、50.06μmol·L-1。结论:SV、AV对两种肿瘤细胞均有抑制作用,抑制率大小呈剂量依赖性,不同他汀类药物对肿瘤细胞的抑制作用存在差异。

关键词:辛伐他汀;阿托伐他汀;结肠癌细胞;肺癌细胞;半数抑制浓度

他汀类药物是胆固醇生物合成中甲羟戊酸合成所需羟甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A, HMG-Co A)还原酶的抑制剂,广泛用于降脂治疗,对于心血管疾病的治疗具有重要意义[1]。近些年来他汀类药物的其他多种细胞生物效应,尤其是抗肿瘤作用,逐渐受到重视。研究已经发现多种他汀类药物,可以通过抑制类异戊二烯中间体的合成,来抑制蛋白的翻译后修饰,通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和抗血管生成发挥抗肿瘤作用[2-4],且他汀类药物还能增加癌细胞对化疗药物的敏感性。

目前辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)是他汀类药物抗肿瘤作用相关研究的典型代表。两者均为脂溶性他汀类药物,但两者的分子结构不同,已有研究发现SV和AV在发挥调脂和抗肿瘤作用中的等效剂量、生物利用度、蛋白结合和消除、遗传药理学因素和细胞作用等均存在差异。相同剂量的AV和SV对心血管的作用可以是相反的[5]。大量的临床试验和动物模型也证实,辛伐他汀和阿托伐他汀对结肠癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长均有抑制作用[6-8]。通过以细胞为基础的基因芯片和生物信息学分析也为他汀类药物的抗肿瘤作用提供支持依据[9]。肺癌和结肠癌是严重威胁全球人类健康的恶性肿瘤疾病,尤其是发展中国家,有研究报道2023年肺癌、结肠癌、乳腺癌等的发病率在这些国家将增长60%[10]。目前肺癌和结肠癌的化疗方案得到广泛应用,使得癌症患者的寿命有所延长,新的抗肿瘤药物研究也成为社会关注的一大热点。已有研究发现,在体外实验中,不同浓度的洛伐他汀对卵巢癌、神经母细胞瘤、宫颈癌细胞的抑制作用存在差异[11]。辛伐他汀对于肺癌细胞、结肠癌细胞抑制作用具有剂量依赖性[12,13],但尚未深入研究其最适抑制浓度及测定其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。

根据已有研究,本实验通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定AV、SV对人结肠癌细胞株HCT-116、人肺癌细胞株A549的增殖抑制率和IC50,从而比较不同他汀类药物的不同浓度对不同肿瘤细胞的细胞毒作用,同时为今后有关他汀类药物对人肿瘤细胞的作用机制的研究奠定基础,为临床用药和化疗提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

HCT116细胞株为人结肠癌上皮来源细胞,A549细胞株为人肺腺癌来源细胞,均由原华西医科大学感染免疫研究室提供,所用培养液为DMEM高糖细胞培养液(成都哈里生物工程有限公司),内含12%小牛血清(成都哈里生物工程有限公司) 及100μg·ml-1青霉素、100μg·ml-1链霉素,于37℃, 5%CO2饱和湿度孵箱中培养,每2天换液传代一次。二甲基亚砜(DMSO)购自成都宝信实验仪器经营部。SV、AV为纯品(大连美仑生物技术有限公司)纯度>99%,用DMSO溶解稀释成10μmol·ml-1,过滤除菌,-20℃避光冻存。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自成都宝信实验仪器经营部,用PBS缓冲液溶解稀释至5 mg·ml-1,过滤除菌,-20℃避光冻存。快速瑞姬氏染液(规格:30 ml)购自南京建成科技有限公司。

1.2 仪器

RDS2-302-125型液氮罐(成都液氮容器公司),0406-1型离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂),SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司),MCO-15AC二氧化碳培养箱(日本三洋电机),TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司),Bio-Rad i Mark美国酶标仪(上海滕柔仪器设备有限公司),CHK-213倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3 细胞复苏与培养

将HCT116细胞株、A549细胞株从液氮中取出,37℃水浴解冻1~2 min,分别加入2 ml含12%小牛血清、100 U·m L-1青霉素和100 U·m L-1链霉素的DMEM高糖培养液, 1200 r·min-1离心3 min,弃上清,用相同培养液使细胞重悬,分装于培养瓶(5 ml培养液),在5%CO2、37℃饱和湿度细胞培养箱中常规培养。每2天换液传代一次。

1.4 细胞形态观察

当细胞(对数生长期)融合达80%时,0.25%胰蛋白酶消化,并计数。用DMEM高糖培养液悬浮调整细胞密度至2.5×104·ml-1,接种于6孔板中,每孔加入2 ml细胞悬液。待接种完毕后,将6孔板放入5%CO2、37℃饱和湿度细胞培养箱过夜。待板中细胞贴壁后,小心吸弃孔中培养液,进行加药处理。设置阴性对照组(3个复孔),每孔分别加2 ml DMEM高糖培养液。SV、AV组药物浓度均为15、25、50μmol·L-1。每孔分别加药2 ml。加药完毕后,放入5%CO2、37℃饱和湿度细胞培养箱并计时。加药处理完成后24 h后,使用快速瑞氏-姬姆萨染液进行染色后,在倒置镜下观察细胞形态。

1.5 MTT法测定药物对细胞的抑制率

取对数生长期细胞,用胰蛋白酶消化后并计数。调整细胞密度至2×104·ml-1,接种于96孔培养板,并设置空白对照组(调零孔)。待接种完毕后,将96孔板放入5%CO2、37℃饱和湿度细胞培养箱过夜。待板中细胞贴壁后,小心吸弃孔中培养液,进行加药处理。设置阴性对照组,HCT116细胞实验的SV组药物浓度为15、25、30、50、60μmol·L-1;HCT116细胞实验的AV组药物浓度为12.5、25、50、75、100μmol·L-1。A549细胞实验的AV、SV组药物浓度为6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。每个浓度设置5个复孔。加药完毕后,放入5%CO2、37℃饱和湿度细胞培养箱并计时。加药处理完成后44 h,取出96孔板,向阴性对照组、SV和AV组分别加入5 mg·ml-1MTT溶液,每孔10μl,空白对照组不做处理,放入细胞培养箱继续培养。4 h后,取出培养板,小心吸弃各孔中液体,每孔加入100μlDMSO溶液,振荡10 min使结晶充分溶解,用酶联免疫检测仪490 nm波长测各孔吸光值(OD值)并记录。上述操作需小心避光。

1.6 统计分析

按照下列公式计算各实验组抑制率:抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。重复上述实验操作3次,获取平均抑制率,并计算出标准差。计数资料以±SD表示,采用SPSS 13.0进行统计学分析,获取IC50值[14]。采用Graphpad 5.0对不同组别进行单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞形态观察

阿托伐他汀和辛伐他汀均具有明显的细胞抑制作用。在倒置镜下观察细胞形态,阴性对照组细胞贴壁生长,形态数量正常。加药组细胞大小明显较对照组小,同一视野下,加药组细胞细胞数量减少,且高浓度组细胞抑制作用明显高于中、低浓度,如图1所示。

2.2 MTT法测定药物对细胞的抑制率

MTT法检测并计算所得不同浓度SV、AV对HCT116、A549细胞抑制率大小,如表1所示。在一定范围内,随着药物浓度的增加,药物对细胞的抑制率明显增加(P<0.01)。中低浓度的AV对人结肠癌HCT116细胞、人肺癌A549细胞的抑制作用高于同浓度SV的肿瘤抑制作用(P<0.01)。同一种他汀类药物对于不同肿瘤的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度SV对HCT116细胞抑制率如图2A所示,IC50值为42.992μmol·L-1。不同浓度AV对HCT116细胞抑制率如图2B所示,IC50值为47.845μmol·L-1。不同浓度SV对A549细胞抑制率如图2C所示,IC50值为41.5μmol·L-1。不同浓度AV对A549细胞抑制率如图2D所示,IC50值为50.06μmol·L-1。

图1　AV、SV对HCT116细胞、A549细胞形态的影响(×40)A-D为不同浓度阿托伐他汀作用于HCT116细胞;E-H为不同浓度阿托伐他汀作用于A549细胞;I-L为不同浓度辛伐他汀作用于HCT116细胞;M-P为不同浓度辛伐他汀作用于A549细胞。

表1　不同浓度SV、AV对HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

表1　不同浓度SV、AV对HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

抑制率(100%)剂量(μmol·L-1) 6.25　12.5　15　25　30　50　60　75　100 SV-HCT116　-　-　31.5±2.4　 40.4±1.1　 50.1±2.5　 59.5±1.8　 66.8±1.0　-　-AV-HCT116　-　24.7±0.3　-　42.3±1.1　-　49.8±0.4　-　65.3±1.6 71.3±0.7 SV-A549　15.5±9.9　 18.3±9.4　-　32.3±5.8　-　44.3±7.3　-　-　79.0±3.5 AV-A549　21.5±1.7　 33.6±1.1　-　42.9±0.5　-　51.4±1.1　-　-　70.5±0.7

图2　不同浓度他汀类药物对肿瘤细胞的增殖抑制

3 讨论

结直肠癌、肺癌是全球常见癌症疾病,严重威胁人类健康生存,一直以来都是全球关注的焦点[15]。早期的恶性肿瘤的治疗以手术治疗为主,常伴有术后放化疗,化疗药物主要有氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、替加氟/尿嘧啶、奥沙利铂、依立替康等[16]。除此之外,肿瘤的治疗方式还有分子靶向治疗,如西妥昔单抗和贝伐单抗。近年来,他汀类药物抑制肿瘤生长的作用得到广泛认可,有流行病学调查显示长期服用他汀类药物组患结肠癌的风险要比不服用他汀类药物组低47%[17]。目前有关他汀类药物对肿瘤作用机制的研究多集中在细胞水平,其可通过干扰多条信号通路,影响细胞周期来发挥抗肿瘤作用,同时他汀类药物对正常细胞的影响较小,因而是一个十分具有前景的抗肿瘤药物。

本实验采用的MTT用于检测药物作用于细胞的抑制率具有方便快捷、简单易行、无放射性等特性,使得其不仅广泛用于肿瘤细胞机制相关研究也广泛用于临床,通过癌细胞药敏实验对肿瘤化疗有重要指导意义。

本实验以MTT法测定不同浓度的SV、AV对HCT116、A549的细胞毒作用,验证了他汀类药物对细胞增殖确实有抑制效应,结合已有的文献报道,通过比较不同他汀类药物对不同肿瘤细胞增殖抑制效应的不同点,说明SV与AV对肿瘤的抑制作用存在差异。本实验通过测定不同他汀类药物对不同肿瘤细胞的IC50,不仅为后期开展他汀类药物对肿瘤细胞作用机制的相关研究提供理论基础和实验依据,而且对新的抗不同肿瘤药物的开发,临床应用剂量等具有指导意义,同时也为今后他汀类药物在不同肿瘤的临床应用提供依据。

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Study on the effects of atorvastatin and simvastatin on human colon cancer and lung cancer cells*

Xie Ya-Lei1,He Jin-Zhao1,Li Qiong2,Zhu Ling2△
(1.Basic Medical Base Class 2011,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041; 2.Department of Pharmacology,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:To measure the cytotoxic effects of the statins on human cancer cells.Methods:The cytotoxic effects of the statins on human colon cancer cells HCT116 and lung cancer cells A549 were measured by MTT to determine IC50values of atorvastatin and simvastatin on HCT116 and A549.Results:IC50values of atorvastatin on HCT116 is 42.992μmol·L-1,IC50values of simvastatin on HCT116 is 47.845μmol·L-1·IC50values of simvastatin on A549 is 41.5μmol·L-1,IC50values of atorvastatin on A549 is 50.06μmol·L-1.Conclusion:SV and AV could inhibit the proliferation of cancer cells.Statins inhibit cancer cells in a dosedependent manner,different statins have different effects on cancer cells.

Key Words:Simvastatin;Atorvastatin;Colon cancer cells;Lung cancer cells;IC50values

(收稿日期：2015-8-24)

通讯作者:△朱玲,女,教授,主要从事化疗药理学、时间药理学研究, Email:zhuling529@163.com。

作者简介:谢亚磊,男,四川大学2011级基础医学本科生,Email:ange10070420@163.com。

*基金项目:国家基础科学人才培养基金能力提高项目资助(编号: J1103604)