多烯紫杉醇对乳腺癌细胞T47D增殖与凋亡的影响及其机制研究

柳青(曲靖市第一人民医院肿瘤科,云南曲靖 655000)

多烯紫杉醇对乳腺癌细胞T47D增殖与凋亡的影响及其机制研究

柳青
(曲靖市第一人民医院肿瘤科,云南曲靖 655000)

摘要目的:观察多烯紫杉醇对人乳腺癌细胞T47D增殖与凋亡的影响及其机制研究。方法:用不同浓度(0、5、10、20 nmol·L-1)多烯紫杉醇作用于人乳腺癌细胞T47D后,采用MTT法观察多烯紫杉醇对人乳腺癌细胞T47D增殖的影响,并使用流式细胞术及Hoechst33258染色检测多烯紫杉醇对T47D细胞凋亡的影响,采用RT-PCR检测T47D细胞bcl-2 m RNA表达情况。结果:经多烯紫杉醇处理后,MTT结果显示T47D细胞生长抑制率显著上升(P<0.05),流式细胞术检测显示T47D细胞凋亡率显著升高(P<0.05),并且Hoechst33258染色检测T47D细胞呈凋亡状态。此外,RT-PCR检测T47D细胞bcl-2 m RNA表达水平降低(P<0.05)。结论:多烯紫杉醇通过诱导凋亡能抑制人乳腺癌细胞T47D的增殖,这可能与其下调bcl-2 m RNA表达有关。

关键词:多烯紫杉醇;T47D细胞;增殖与凋亡;Bcl-2 mRNA

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,占女性所有肿瘤的18%[1]。尽管WHO数据显示中国女性乳腺癌发病率最低,但我国乳腺癌发病率依然达到了23/10万,占全国恶性肿瘤的7%~10%,成为女性发病率最高的恶性肿瘤[2]。目前乳腺癌的治疗手段主要有外科手术、放射治疗和化疗等,但是手术治疗给患者所带来的是严重的身心伤害,放射和化疗也对患者的身体产生严重的副作用损伤。因此,发展新的治疗策略,从分子靶点上寻找一种高效低毒的抗乳腺癌药物对提高乳腺癌病人的生存率和后期康复具有重大意义。

多烯紫杉醇前体是从欧洲紫杉的针叶中提取,经半合成而获得,近年来,国内外已有研究表明多烯紫杉醇对肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病等恶性肿瘤能诱导其细胞凋亡[3-4]。因此,本实验以人乳腺癌细胞T47D作为研究对象,观察不同浓度多烯紫杉醇作用T47D细胞株后细胞增殖、凋亡的情况,并观察T47D细胞bcl-2 mRNA表达水平的变化,探讨其可能的作用机制,为多烯紫杉醇临床应用于乳腺癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

T47D细胞株(上海细胞生物研究所),RPMI1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司),多烯紫杉醇(法国安万特公司),荧光染料Hoechst33258、MTT(美国Sigma公司),流式细胞仪(美国COULER公司),V-FITC凋亡检测试剂盒(上海碧云天研究所),其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

T47D细胞在含10%胎牛血清(FBS)和100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1链霉素的RPMI-1640培养基中,37℃,5%CO2条件下培养。

1.2.2 药物配制

多烯紫杉醇用DMSO配制成浓度1μmol·L-1的药液,置于4℃冰箱避光保存,用时以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释成所需要的浓度。

1.2.3 T47D细胞增殖活性检测

采用MTT法检测T47D细胞增殖活性。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,按5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中,每孔加入细胞悬液100μl。细胞贴壁后,分别加入多烯紫杉醇使得终浓度为(5、10、20 nmol·L-1),另设对照组(不含多烯紫杉醇),每组设5个副孔。药物分别作用24、48、72 h后,弃上清,以MTT法用酶标仪测每组的吸光值(A490),实验独立重复3次。

1.2.4 T47D细胞凋亡率检测

采用流式细胞术检测T47D细胞凋亡率。将消化后收集到的T47D细胞悬液调整浓度,按每孔1×106个细胞接种到6孔板中。待细胞完全贴壁后,加入含不同浓度多烯紫杉醇(5、10、20 nmol·L-1)的完全培养基,另设对照组(加入等体积完全培养基),每组设5个副孔。培养48 h后,收集各组的细胞,以预冷的PBS溶液洗涤3次后,用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)(50μg·ml-1)室温避光染色15 min后,流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.5 T47D细胞凋亡形态观察

采用Hoechst染色法观察T47D细胞凋亡形态。将对数生长期细胞接种至6孔板中,待细胞完全贴壁后,用不同浓度多烯紫杉醇(5、10、20 nmol·L-1)处理T47D细胞,另设对照组(加入等体积完全培养基),每组设5个副孔。作用48 h后,弃上清,先后加入固定液和Hoechst33258染色液,37oC条件下染色10 min。以荧光倒置显微镜检测,激发波长350 nm,镜下观察细胞形态变化。

1.2.6 T47D细胞bcl-2 mRNA表达检测

采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测T47D细胞bcl-2 m RNA表达。各浓度多烯紫杉醇(0、5、10、20 nmol·L-1)处理T47D细胞48 h后,收集T47D细胞总RNA,经紫外分光光度计测总RNA纯度和含量,将总RNA逆转录为cDNA。然后用用PCR仪进行扩增,β-actin上游引物:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3';下游引物:5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3',扩增片段长度416 bp。Bcl-2扩增上游引物:5'-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3';下游引物5'-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-3',扩增片段长度234 bp。PCR反应条件: 95oC预变性3 min,93oC 30 s,56oC30 s,70oC 60 s,共进行35个循环;72oC 5 min,4oC holding。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析系统记录分析。以β-actin为内参,结果以bcl-2/β-actin密度比值表示。

1.3 统计学分析

实验数据用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析,以±SD表示,P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 多烯紫杉醇抑制T47D细胞增殖

MTT实验结果发现,高浓度多烯紫杉醇对T47D细胞的增殖起明显抑制作用,图1可看出,与对照组比较,随多烯紫杉醇浓度增加和作用时间延长,多烯紫杉醇处理组(5、10、20 nmol·L-1) T47D细胞数目显著减少,增殖能力受到明显抑制。

图1　不同浓度多烯紫杉醇处理T47D细胞后24、48、72h后的增殖情况

2.2 多烯紫杉醇促进T47D细胞的凋亡

对T47D细胞进行Hoechst33258染色检测发现,对照组T47D细胞核形态均匀,结构正常,见图2A。而多烯紫杉醇处理组(5、10、20 nmol·L-1)的T47D细胞中可见典型的细胞凋亡形态,包括细胞核碎裂和细胞皱缩,见图2B-2D。对T47D细胞进行流式细胞仪测定发现,与对照组比较,多烯紫杉醇处理组(5、10、20 nmol·L-1)的凋亡细胞率均明显升高,凋亡率随药物浓度增加逐渐上升,各实验组间差异具有统计学意义(P<0.05),见图3。

图2　不同浓度多烯紫杉醇处理T47D细胞48h的荧光显微照片(×400)注:A:对照组细胞;B:5nmol·L-1多烯紫杉醇;C:10nmol·L-1多烯紫杉醇;D:20 nmol·L-1多烯紫杉醇;箭头所示为细胞出现核碎裂和细胞皱缩

图3　不同浓度多烯紫杉醇处理T47D细胞48h后用流式细胞仪检测细胞凋亡率注:与对照组比较,*P<0.05

2.3 多烯紫杉醇降低bcl-2 m RNA表达

RT-PCR检测结果发现,与对照组比较,多烯紫杉醇组(5、10、20 nmol·L-1)的T47D细胞bcl-2 m RNA表达水平随药物浓度增加明显降低,呈剂量依赖性,各药物组间差异具有统计学意义(P<0.05),见图4。

3 讨论

乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤,发病率在我国居女性恶性肿瘤的第二位[5]。目前针对乳腺癌的治疗尚无统一方案,因此寻找新的抗乳腺癌药物,是治疗乳腺癌的热点问题之一。多烯紫杉醇属于细胞周期特异性抗微管药物,具有促微管聚合及使细胞分裂停滞的作用[6]。1994年FDA批准紫杉醇用于治疗复发转移性乳腺癌,研究表明此药治疗乳腺癌效果较好[7],而多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物,相比紫杉醇生物利用度好,毒副作用更小。在本次实验中,我们选取乳腺癌T47D细胞作为模型,用不同浓度多烯紫杉醇处理乳腺癌T47D细胞,观察多烯紫杉醇对于乳腺癌T47D细胞增殖和凋亡发生的作用及可能的机制。

MTT分析是一种比色分析,可以反映细胞增殖能力[8]。本研究中通过MTT实验发现,经过多烯紫杉醇处理后的T47D细胞在72 h内增殖速度明显降低。并且经Hoechst染色和流式细胞仪检测显示T47D细胞出现明显的凋亡形态学变化,且凋亡数目显著增多,提示多烯紫杉醇抑制细胞增殖作用与诱导细胞凋亡有关。

细胞凋亡的调控失常是引发肿瘤的发生的重要因素,现有研究表明线粒体通路是调控细胞凋亡的主要通路[9]。线粒体通路主要由bcl-2家族成员所调控,bcl-2基因是目前公认的抗凋亡基因,通过抑制多种形式的细胞凋亡过程致细胞数目增加,对肿瘤细胞的增殖起促进作用[10]。因此,bcl-2 m RNA表达水平的下降可诱导细胞凋亡。在本研究中发现,随着多烯紫杉醇浓度的增加,乳腺癌T47D细胞bcl-2 m RNA表达水平呈剂量依赖性下降,提示多烯紫杉醇抑制乳腺癌T47D细胞增殖的机制可能与下调bcl-2 m RNA表达相关。

图4　不同浓度多烯紫杉醇处理T47D细胞后bcl-2/β-actin的比值注:与对照组比较,*P<0.05

综上所述,多烯紫杉醇对抑制乳腺癌T47D细胞增殖起显著作用,其机制可能与其诱导T47D细胞凋亡及下调bcl-2 m RNA表达有关。多烯紫杉醇作为临床用药有广阔的前景,其诱导肿瘤细胞凋亡的确切机制还有待深入研究。

参考文献

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3 Kim CH,Yoo JS,Lee CT,et al.FHIT protein enhances paclitaxelinduced apoptosis in lung cancer cells[J].Int J Cancer,2006,118 (7):1692-1298.

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Effects and mechanisms of docetaxel on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cells T47D*

Liu Qing
(Department of Oncology,The First People Hospital of Qujing,Yunnan Qujing 655000)

Abstract Objective:To study the effects and the mechanisms of docetaxel on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell T47D.Methods:Human breast cancer cells T47D was exposed to different doses of docetaxel(0,5,10 and 20 nmol·L-1).MTT assay was applied to determine the effects of docetaxel on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells T47D,while apoptosis was assessed by flow cytometry and Hoechst33258 staining.Next,the expression level of bcl-2 m RNA in T47D cell was analyzed by RT-PCR.Results:After docetaxel treatment,the proliferation of T47D cell was significantly inhibited(P <0.05).The increased apoptotic rates by docetaxel was found in T47D cell by flow cytometry(P<0.05),and docetaxel-treated T47D cell exhibited typical apoptotic morphology.Furthermore,docetaxel resulted in reduced expression of bcl-2 m RNA in T47D cells(P<0.05).Conclusions:Docetaxel could inhibit the growth of human breast cancer cell T47D by induction of apoptosis,which may be related with inhibition of bcl-2 m RNA expression.

Key Words:Docetaxel;T47D;Proliferation and apoptosis;Bcl-2 mRNA

(收稿日期：2015-9-6)

作者简介:柳青,女,主治医师,主要从事甲状腺乳腺外科的研究,Email: ynfg001@163.com。