大蒜素干预下大鼠血清对食管癌EC109细胞凋亡及Survivin表达的影响

梁宗英 侯继申 董晓利 张召 张旭 辛国华

大蒜素干预下大鼠血清对食管癌EC109细胞凋亡及Survivin表达的影响

梁宗英 侯继申 董晓利 张召 张旭 辛国华

目的 研究大蒜素干预下SD大鼠血清诱导食管癌EC109细胞凋亡及其对Survivin蛋白表达的影响。方法 Ⅰ组:以普通灭活SD大鼠血清培养液培养食管癌EC109细胞;Ⅱ组:以大蒜素干预SD大鼠灭活血清培养液培养食管癌EC109细胞;采用AnnexinⅤ-EGFP/PI双染法和亚倍体峰法应用流式细胞仪检测2组食管癌细胞早期和中晚期凋亡率;Survivin蛋白的表达应用Western blot方法检测。结果 Ⅱ组细胞凋亡率明显高于Ⅰ组，差异有统计学意义(P＜＜0.05);Ⅱ组细胞中Survivin蛋白的表达水平明显低于Ⅰ组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 长期大蒜素干预下SD大鼠血清能促进食管癌EC109细胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表达。

大蒜素;大鼠;食管癌;EC109细胞;细胞凋亡;Survivin蛋白

大蒜素的主要成分为二烯丙基三硫化物，是从食用大蒜中提取出的一种具有多种生物活性的混合物［1］。研究发现，在大蒜素具有的多种生物学活性中，除抗菌杀毒、降血脂以及增加机体免疫力等常规功能外，抗肿瘤的作用最为重要［2］。近几年有学者对大蒜素抗癌作用的分子机制进行了广泛深入的研究探讨，但大蒜素对食管癌细胞的凋亡以及Survivin蛋白表达是否有影响研究较少。为了进一步研究探讨大蒜素的抗癌机制，本实验进行了应用长期大蒜素干预下SD大鼠血清诱导食管癌EC109细胞凋亡及其对Survivin蛋白表达的影响研究，为其在食管癌防治中的应用提供实验基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠购于天津医科大学动物实验中心。食管癌EC109细胞株来自西安交通大学研究生教学实验中心。大蒜素购于徐州莱恩药业有限公司(规格:2.5 g/瓶;剂型:粉末)。AnnexinⅤ-EGFP ＜ 试剂盒购于沈阳万类生物科技发展有限公司。小鼠抗人Survivin单克隆抗体购于天津金桥生物技术有限公司。β-Actin一抗和山羊抗小鼠二抗购于美国 Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制备:40只大鼠，正常饲养，无特殊处理。每日给予大蒜素15 mg·kg-1·d-1，肌内注射。24周后，取大鼠内眦静脉血，温浴离心后，分离血清。高温水浴灭活血清，过滤除菌后保存备用。

1.2.2 实验分组:Ⅰ组:以含20%普通SD大鼠灭活血清培养液培养食管癌EC109细胞;Ⅱ组:以含20%大蒜素干预SD大鼠灭活血清培养液培养食管癌EC109细胞。

1.2.3 细胞凋亡率的测定:应用含有两种血清的细胞培养液培养48 h，收集细胞。加入PBS离心，细胞计数后调成设定浓度。取细胞悬液，分别加入AnnexinⅤ-EGFP和PI进行染色后应用流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。同样方法收集2组培养成功的细胞，加入乙醇后固定，4℃离心弃净乙醇，加入磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，室温下间歇摇动，再次离心弃去上清，加入PI染色，室温避光15 min后检测细胞中晚期凋亡率。

1.2.4 Survivin蛋白的表达:取对数生长期细胞接种于培养瓶，应用含有两种不同血清的细胞培养液处理细胞后，提取细胞蛋白质后，进行分离及浓度测定;蛋白稳压电泳后，以2 mA/cm2恒流转膜;用含0.25%脱脂奶粉封闭液中，室温摇动2 h;加一抗4℃孵育过夜;应用TBST缓冲液洗膜后加入二抗室温孵育2 h，洗膜后应用ECL发光法，显像胶片采用薄层色谱扫描仪来测定印迹区带的光密度值。

2 结果

2.1 细胞的凋亡 Ⅱ组早期凋亡率明显高于Ⅰ组，2组差异有统计学意义(P＜0.05);而Ⅱ组中晚期细胞凋亡率较Ⅰ组仍明显增高，统计学差异有意义(P＜0.05)。见表1，图1～4。

表1 2组食管癌EC109细胞凋亡率比较%，±s

表1 2组食管癌EC109细胞凋亡率比较%，±s

注:与Ⅰ组比较，*P ＜0.05

组别 凋亡率早期凋亡率 中晚期凋亡率Ⅰ组2.98±0.93 0.91±0.22Ⅱ组 7.72±1.31* 12.42±1.43*

图1 Ⅰ组EC109细胞早期细胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

图2 Ⅱ组EC109细胞早期细胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

图3 Ⅰ组EC109细胞中晚期细胞凋亡率(亚倍体峰法)

图4 Ⅱ组EC109细胞中晚期细胞凋亡率(亚倍体峰法)

2.2 Survivin蛋白的表达 对曝光X线片扫描后，应用凝胶图像分析处理软件处理后结果显示，Ⅱ组 Survivin蛋白表达量明显低于Ⅰ组。见图5。

3 讨论

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，近年来全球食管癌的发病率和死亡率呈上升趋势［3］。我国一直是食管癌的高发地区，食管癌发病率和死亡率均居世界之首［4］。目前食管癌的治疗仍以手术、放化疗为主要手段，尽管有一定疗效，但常常对机体产生严重的不良反应［5］。因此，加强对食管癌药物预防以及治疗的深入研究，改善食管癌患者的生存质量，延长患者的生存期是临床工作者面临的首要任务。近几年有学者对大蒜素抗癌作用的分子机制进行了广泛深入的研究探讨，但大蒜素对食管癌细胞的增殖以及凋亡是否有影响研究较少。研究食管癌的病因、发展转移机制及对药物的反应性，对食管癌的防治有重要意义［6］。

图5 EC109细胞Survivin蛋白表达水平

细胞凋亡是多细胞生物最常见的一种基本生命活动，是机体维持正常生理活动所必需的，对机体正常功能的维持具有重要意义［7］。无限的细胞增殖并不是人体肿瘤发生的原因，人类某些肿瘤发生的最主要原因的通过抑制细胞凋亡途径或凋亡功能的丧失导致的增殖与凋亡之间的失衡造成的。通过强化凋亡基因活性的表达、诱导细胞凋亡达到杀死或者加速肿瘤细胞的死亡是现代医学防癌、抗癌药物发挥其功能的重要途径。在诸多抑制和影响细胞凋亡的因素中，作用最强研究最多的是Survivin蛋白。Survivin蛋白是一种在人体正常分化组织中不表达而在肿瘤组织中普遍表达的，具有调节细胞分化和抑制细胞凋亡双重功能的小分子量肽类［8］。Survivin通过下调肿瘤细胞 Survivin蛋白的表达量和抑制相关蛋白的功能而实现其强大的抗凋亡作用，从而达到治疗肿瘤的目的［9，10］。目前Survivin抗凋亡作用的机制主要是依赖在细胞凋亡中起核心作用的caspase直接或间接抑制起始因子而抑制凋亡，或者是Survivin基因决定簇缺失或突变而诱导肿瘤细胞发生自发性凋亡，从而抑制肿瘤的生长［11］。体外实验证实，大蒜素的抗肿瘤机制涉及多个靶点，作用机制主要包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡坏死、抗肿瘤血管生成、影响肿瘤细胞信号传递等一系列的化学预防和治疗途径。大蒜素具有抗肿瘤活性不仅表现在其可通过多种途径干扰肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，而且还具有直接杀伤肿瘤细胞的能力，为应用大蒜素治疗和预防癌症提供了理论依据［12］。

本实验结果表明:由实验测得的调亡率结果分析显示，经过大蒜素干预的实验鼠灭活血清培养的食管癌细胞凋亡率明显高于普通血清培养的食管癌细胞，说明大蒜素干预的实验鼠灭活血清可以促进食管癌EC109细胞的凋亡。而且经过Western-Blot技术验证，经大蒜素干预的大鼠血清培养的食管癌EC109细胞Survivin蛋白的表达量较普通大鼠血清组明显下降。说明大蒜素可以通过某些途径抑制Survivin基因对应表达的Survivin蛋白的功能而诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤的目的。大蒜素作为一种纯天然药物，对肿瘤细胞作用的靶点和途径是多方面的，与其他化疗药比较，具有对人毒性小、体内无残留、不易产生耐药性的优势。随着大蒜素抗癌作用研究日趋成熟和深入，大蒜素抑制肿瘤的增殖以及促进凋亡的具体机制还有待进一步深入的研究，这对更好发挥大蒜素抗肿瘤功效具有重要意义［13］。

长期大蒜素干预下SD大鼠血清能促进食管癌EC109细胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表达。大蒜素经过体内生物转化后可以通过某些途径促进细胞凋亡，但促进凋亡的具体机制还有待进一步深入研究。

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12 王广彬，赵瑞杰，王文魁，等.大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡研究进展.动物医学进展，2010，31:73-76.

13 尹春晖，霍诗然.大蒜素抗癌作用及其机制研究进展.食品科学，2009，30:270-272.

The effect of rats serum treated by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells and the expression levels of Survivin

LIANG Zongying* ，HOU Jishen* ，DONG Xiaoli，et al．*Department of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital ofChengde Medical College，Hebei，Chengde 067000，China

Objective To investigate the effect of SD rats serum after intervention by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells cell and the expression levels of Survivin.Methods The groupⅠ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in normal inactivated SD rat serum medium;groupⅡ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in inactivated SD rat serum medium plus allicin，then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinⅤ-EGFP/PI double-standing and hypoploid peak method with flow cytometer，furthermore the expression levels of Survivin were measured by Western Blot.Results The cell apoptosis rates in groupⅡwere significantly higher than those in groupⅠgroup(P＜0.05)，however，the expression levels of Survivin protein in groupⅡ were significantly lower than those in groupⅠ(P ＜ ＜0.05).Conclusion The serum of SD rat after long-term intervention by allicin can promote the apoptosis of esophagus cancer EC109 cells and can inhibit the expression of Survivin protein.

allicin;rat;esophagus cancer;EC109 cell;cell apoptosis;Survivin protein

R 735.1

A

1002-7386(2015)23-3528-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．002

067000 河北省承德市，承德医学院附属医院胸外科(梁宗英、侯继申、张召、张旭、辛国华);河北省石家庄市优抚医院外一科(董晓利)

辛国华，061000 河北省承德市，承德医学院附属医院;E-mail:X215929@163.com

2015-07-20)