清热类药物高效液相色谱分析有效成分含量的方法研究

季晓红

(江苏省张家港市第三人民医院，江苏 张家港 215611)

中药作为中华民族的瑰宝一直沿用了几千年，在疾病的防治上发挥着重要的作用，中药药剂一直是中药中最具价值的部分，具有其独特的治疗优势［1］。首先中药制剂通过各种药味的协同配合，形成具有独特疗效和低毒副作用的优势，其次中药制剂具有持久性、稳定性和高效性，其药效使用率高，另外中药制剂的储存相对较为方便，给药方式简单［2］。近年来我国的中药制剂的研制取得了很大的进展，特别是中药复方的水平较之前有了很大的提高。事实上中药制剂的制备是一个较为复杂的过程，成分的提取需要用到不同的工艺，这种技术上的限制也造成了中药制剂的药物控制上不能做到面面俱到，质量出现良莠不齐的表现［3］。为了让中药制剂的质量得到保证，对其含量和有效成分进行分析和把握，才能够让中药制剂的制备更为的可控和精确，本文通过高效液相色谱法对清热类药物的有效成分进行研究，总结提取的相关方法，供今后的中药提取参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、细胞与仪器

试剂:大黄素(中国药品生物制品检定所，批号115239-202100);黄芩苷(中国药品生物制品检定所，批号0754-9872);盐酸小檗碱(中国药品生物制品检定所，批号54633-30984)。清肺抑火片分别由三家公司提供:云南白药集团大理药业有限公司，批号110419;云南省曲靖药业有限公司，批号110423;修正药业集团股份有限公司，批号110644。磷酸二氢钾(分析纯，上海硕盟生物);乙腈、甲醇(色谱纯，美国DIKMA公司);水为双蒸水。

仪器:高效液相色谱仪(美国Queue systems);电子分析天平(日本奥林巴斯);超声波清洗机(美国BD公司);高转速冷冻离心机(德国BiofugeStratos)。

1.2 方法

色谱柱:Waters Atlantis dC18(250mm×4.5mm，5μm);流动相:0.01mol/L的KH2PO4溶液(H3PO4调pH值为2.8)，乙腈(95∶5，V/V);洗脱程序采用梯度洗脱法:0～5min，26%A→26%A;5～10min，26%A→48%A;10～19min，48%A→60%A;流速1.0ml/min;波长根据流动相切换0～5min，316nm;6～10min，347nm;10～19min，254nm，温度控制在28℃，进样量每次20μl。

1.3 对照品溶液的制备

盐酸小檗碱、大黄素、黄芩苷取适量，通过甲醇稀释制备到浓度为340、448、424μg/ml的单一对照品，分别取盐酸小檗碱5.0ml、大黄素4.0ml、黄芩苷13.0ml，再加入色谱级的甲醇稀释得到混合对照品进行储存。

1.4 供试品溶液的制备

对样品进行研磨，取0.3g至100ml的量瓶中，加入70%甲醇15ml，进行超声，约1h后静置，离心过滤，取滤液转移至容量瓶当中，稀释后摇匀，得到供试品。

1.5 提取方法的选择

样品的提取率根据公式计算:Y=(C×V)×10-3/W，其中C为标准曲线求出来的样品浓度，V为溶液的体积，W为样品的重量。为了使被测的清热药物全部提取完整，本研究采用不同提取时间、溶液比列等方法进行提取，摸索出最佳的甲醇浓度和超声时间。

1.6 流动相的选择

主要考察了甲醇-磷酸二氢钾溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-三乙胺溶液、甲醇-三乙胺溶液的流动相选择，通过分离的效果选择柱压的大小，是否有拖尾的情况选择合适的流动相。

2 结果

2.1 线性关系的考察

取出对照品的混合储存液，对三种对照品分别制备一系列浓度的溶液，其中盐酸小檗碱分别为2.24、4.48、8.96、17.92、44.8、89.5μg/m l，大黄素分别为1.36、2.72、5.44、10.88、27.2、54.5μg/ml，黄芩苷分别为5.512、11.02、22.06、44.10、110.2、220.5μg/ml。吸取20μl注入色谱仪中，以峰面积Y对浓度X进行线性观察，回归方程分别为盐酸小檗碱:Y=41.93X-0.0392;大黄素:Y=19.96X-45.52;黄芩苷:Y=31.34X-46.98。结果，盐酸小檗碱2.24～89.60μg/ml;大黄素:1.36～54.40μg/ml;黄芩苷5.51～220.50μg/ml范围内三者均与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 精密度实验

吸取混合储存液20μl，进行6次重复，对峰面积进行测定。结果显示，三者的峰面积RSD分别为小檗碱1.4，大黄素1.7，黄芩苷0.87，结果见表1。

表1 精密度实验结果

2.3 稳定性实验

取储存液20μl，分别在0、2、4、6、8、12h六个时间点进行检测，对峰面积进行计算。结果显示，三者的峰面积RSD分别为小檗碱0.74，大黄素1.8，黄芩苷2.1，溶液在12h之内都处于稳定状态，见表2。

表2 稳定性实验结果

2.4 重复性实验

同一样品，测定供试品，对其峰面积进行检测。三者的峰面积RSD分别为小檗碱0.69，大黄素1.8，黄芩苷1.2，说明本方法检测重复性好，见表3。

表3 重复性实验结果

2.5 样品含量测定

样品分别为三个厂家的样品，分别取3份按上述的方法制备成供试品，然后根据上述的对照品测试的色谱条件进行进样检测，对峰面积测定，计算出含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果

2.6对照品混合溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图见图1。

3 讨论

中药制剂的质量监控早在《太平惠民和剂局方》中就有相关的记载。随着近年来我国中药制剂的发展和国际化要求，中药复方制剂的药物控制也应该得到更为深入的研究，质量的控制显得尤为关键，由于中药制剂是一个相当复杂的提取过程，其质量监控难以全面化，因此质量控制问题一直是阻碍中药制剂发展并影响其国际化、产业化进程的重要原因。有效成分的控制成为中药现代化的重要问题，鉴于中药分析技术的不断发展，新的控制模式和检测技术的推出，给中药的质量标准提供了重要的思路。

现阶段中药制剂研究领域的质量控制应该遵循药物质量准则，主要方法就是药效的物质基础研究，利用现代的分离技术如超滤技术、超声技术、膜分离技术等对药物进行提取分离，在药效的基础上对有效成分进行药理的分析，寻找出复方治疗中有效成分，从而作为药物含量测定的标准。

图1 对照品混合溶液(A)和供试品溶液(B)色谱图

清热类药物作为广泛应用于临床的常用药物，该类药物不仅仅能够抗病源微生物，还可以调节人体的免疫功能，具有广泛的抗炎解热的药理活性，通过调节自身的免疫力提高人体的抗病能力。本文通过摸索实验条件，以清肺抑火片为例，探讨清热类药物高效液相色谱分析有效成分的含量的方法学，选取了不同产家的清热类药物中清肺抑火片中黄芩、黄柏、大黄的活性成分黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素，通过高效液相色谱分析建立三种指标成分含量的同步测定分析方法。结果显示，高效液相色谱分析可以取得良好的分离效果，获得较高的产品质量，虽然不同厂家的药物均达到合格药品的标准，但是药物之间还是存在一定的差异。

综上所述，本研究拓展了高效液相色谱在药物质量的控制和监督方面的实际应用，证实了高效液相色谱分析对于清热类药物具有准确性高、方法精密度好的特点，符合中药药物的检测要求，通过不同厂家的药物的对比分析，均为合格药品，但是药物存在一定的差异性，这可能与原材料的产地以及厂家的制备工艺有关，在差异在可控范围之内都将发挥一定的临床疗效，这也提示了仍有许多中药的可控性问题需要我们进一步深入研究，从全方位多角度评价中药制剂的优劣。

［1］李文烈，曹海芳，魏刚，等.中药制剂质量控制的研究进展［J］.中国执业药师，2012，9(7):32-35.

［2］杨胜，张定堃，苏柘僮，等.中药复方制剂质量控制的研究［J］.中国医药生物技术，2010，5(5):387-391.

［3］伍振峰，郑琴，杨明，等.中药制剂质量控制的方法模式分析与研究［J］.中国中药杂志，2012，37(9):1332-1336.