双氢麦角碱对急性酒精中毒大鼠海马DG 区氨基酸含量的影响

许银花，吴 光，郑雪梅，崔松彪

急性酒精中毒(Acute alcohol intoxication)，是指一次大量饮酒造成的急性中毒，常见于集会性豪饮过程中［1］。酒精急性中毒造成中枢神经系统全面抑制状态，并非人们普遍认为的中枢兴奋性作用［2］。在中枢神经系统内广泛存在着氨基酸类神经递质，它们具有代谢作用，还作为神经递质对维持正常的脑功能起着重要作用。根据其对中枢神经元的作用不同可分为两大类:兴奋性氨基酸(excite amino acids，EAAs)，包括谷氨酸(glutamate，Glu)和天冬氨酸(aspartate，Asp);抑制性氨基酸(inhibitory amino acids，IAAs)，包括甘氨酸(glycine，Gly)、牛黄酸(taurine，Tau)、谷氨酰胺(glutamine，Gln)、γ-氨基丁酸(gamma aminobutyfic acid，GABA)和丙氨酸(alanine，Ala)。在脑功能正常活动中EAAs 和IAAs之间保持着动态平衡。病理状态下EAAs，尤其是Glu 可导致神经元变性而引起多种神经元性疾病，而IAAs 对神经元损伤有一定的保护作用。目前已明确Glu 不仅作为兴奋性神经递质在神经传递过程中起作用，而且还是一种神经毒性物质，有可能在诸如帕金森病，亨廷顿病、老年性痴呆及急、慢性酒精中毒等疾病的发生、发展过程中起作用［3］，但是Glu及其它氨基酸类神经递质在急性酒精中毒中的作用目前尚不清楚。

双氢麦角碱能增强已减退的神经原能量代谢、改善脑部血液循环、激活突触的神经传导功能、抑制血小板凝聚并防止血栓形成，主要用于改善与老年化有关的精神退化的症状和体征、急慢性脑血管病后遗的功能和智力减退的症状、轻重度血管性痴呆、血管性头痛等。本实验用急性酒精中毒大鼠模型，利用脑内微量透析法及高效液相色谱法在大鼠清醒状态下测定急性酒精中毒时海马齿状回(dentate gyrus，DG)区细胞外液中部分氨基酸类神经递质的含量，并以双氢麦角碱作为干预药物，观察急性酒精中毒对海马DG 区部分氨基酸类神经递质含量变化的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备 实验选用体重在(270 ±30)g 的Wistar 雄性大鼠18 只，普通级，由延边大学医学部实验动物科提供。实验动物随机分为对照组、酒精组和治疗组。酒精中毒组大鼠胃内灌入50%食用酒精(由和龙制酒厂提供)，每次0.5 ml，每10 min 灌1 次，直到大鼠出现酒精中毒状态为止。酒精中毒状态以大鼠翻正反射(righting reflex)消失为指标［4］。对照组给予同等剂量的生理盐水。

1.2 手术方法 大鼠称重，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，俯卧位固定于大鼠立体脑定位仪上，大鼠牙槽低于耳内切线3.3mm。参照Bliss 等［5］的方法进行脑部定位。根据Paxinos 和Watson［6］图谱，以后囟为参考点，量得的前后囟之间距离除于8 就等于抬高前囟的高度。以前囟为参考点，将透析探针套管插入到海马DG 区(B:3.3～3.5 mm;L:1.6～1.9 mm;H:3.2～3.5 mm)后用拧绕在外套管的金属线缠绕于固定头部的3 个螺丝，牙托粉固定。术后透析膜的外套管内插入自制的透析导管，待收集灌流液。实验完毕，动物过量麻醉处死，取脑固定于10%甲醛溶液中，3 d 后冰冻切片、染色、进行组织学鉴定，定位不准确者不计入分析。

1.3 脑部微量透析及样本收集 动物术后1 d微量透析探针连接微量泵，以1.5 μl/min 速度向大鼠海马DG 区灌流Ringer’s 液，稳定30 min，同时经样本收集器连续收集样本3 管，每管收集10 min，收集量为15 μl。随后灌胃(对照组灌胃生理盐水，酒精组与治疗组灌胃酒精;30 min 后，对照组与酒精组灌胃生理盐水，治疗组灌胃双氢麦角碱)30 min 后，再次收集灌流液3 管，-80℃冰箱中冷冻保存，以备进行氨基酸含量的分析。

1.4 微量分析方法 参照Jin 等方法［7］配制衍生剂1 溶液和衍生剂2 溶液。取收集好的样本12 μl 和4 mmol/L 的OPA 溶液在室温下反应2.5 min，抽取反应液10 μl，注入到生物活性物质微量分析系统(日本Eicom 公司产)。以0.5 ml/min速度通过高效液相分离柱(SC-50DS)和电化学检测器(ECD-300)测定样本中氨基酸的含量。每次样本分析均以稀释的氨基酸标准液(2 ml)作为基础。

1.5 数据处理方法 数据处理采用SPSS 11.5统计软件，所有数据均用()表示，统计学处理采用单因素方差分析和组间比较t 检验，显著性差异水平定为P ＜0.05。

2 结果

2.1 酒精中毒对大鼠海马DG 区内几种氨基酸的变化影响

2.1.1 酒精中毒前后细胞外液中Asp、Glu、Gln 的变化情况 酒精组的Asp，Glu 由酒精中毒前0.370 ±0.104 mv·s 和0.484 ±0.156 mv·s 增加到0.972 ±0.256 mv·s 和1.128 ±0.292 mv·s(均为P ＜0.05)(见图1)，其变化值与对照组灌胃生理盐水前后的变化值比较有显著的差异(P ＜0.05)(见图1、图5)。酒精组在酒精中毒前后Gln含量没有明显变化(P ＞0.05)(见图2)。

图1 海马DG 区内Asp，Glu 含量的变化

图2 海马DG 区内Gln 含量的变化

2.1.2 酒精中毒前后细胞外液中Gly、Tau、Ala的变化情况 Gly 在酒精中毒后显著增加(P ＜0.05)，由酒精中毒前0.775 ±0.162 mv·s 增加到1.845 ±0.483 mv·s(见图3)，其变化值与对照组灌胃生理盐水前后的变化值比较有显著的差异(P＜0.05)(见图3、图5)。酒精组在酒精中毒前后Tau、Ala 含量没有明显变化(均为P ＞0.05)(见图4)。

图3 海马DG 区内Gly 含量的变化

图4 海马DG 区内Tau，Ala 含量的变化

图5 各组海马DG 区氨基酸水平变化的典型色谱图

2.2 双氢麦角碱对急性酒精中毒大鼠海马DG区内几种氨基酸变化的影响

2.2.1 双氢麦角碱对急性酒精中毒大鼠海马DG 区内Asp、Glu、Gln 变化的影响 药物组在灌胃前后Asp、Glu、Gln 含量没有明显变化(均为P ＞0.05)(见图1、图2)，其Asp、Glu 变化值与酒精组灌胃酒精前后的变化值比较有显著的差异(均为P＜0.05)(见图1、图5)，而Gln 的变化值没有明显变化(P ＞0.05)(见图2)。

2.2.2 双氢麦角碱对急性酒精中毒大鼠海马DG 区内Gly、Tau、Ala 变化的影响 药物组在灌胃前后Gly、Tau、Ala 含量没有明显变化(均为P ＞0.05)，Gly 变化值与酒精组灌胃酒精前后的变化值比较有显著的差异(P ＜0.05)(见图3、图5)，而Tau、Ala 的变化值没有明显变化(均为P ＞0.05)(见图4)。

3 讨论

饮酒是一种社会风俗，有着数千年历史。饮酒能给人们带来一时欢愉，也给社会、家庭以及饮酒者健康带来一系列的问题。急性大量酒精摄入将强烈抑制海马、大脑皮质及小脑NMDA 受体，会引起患者嗜睡、意识模糊、陶醉感及共济失调等急性醉酒症状。酒精的拮抗作用具有区域特异性［8］。本实验用海马作为研究急性酒精中毒时的核团，采用高浓度酒精灌胃方法建立急性酒精中毒模型，同时用微透析采样技术及高效液相色谱法测定了急性酒精中毒时大鼠海马DG 区细胞外液中几种氨基酸类神经递质的水平。

神经递质是中枢联系的重要物质，氨基酸类神经递质分为兴奋性氨基酸(EAAs)和抑制性氨基酸(IAAs)，在脑正常活动中两者保持动态平衡，病理状态下动态平衡被打破。EAAs 广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中。EAAs 具有双重作用。包括正常条件下对神经元的强烈兴奋作用和过量释放引起神经毒性作用［9］。急性酒精中毒脑损伤多表现为神经系统的兴奋，神经细胞出现水肿坏死，最终出现脑萎缩。临床上急性酒精中毒时引起的症状产生被认定有Glu 能神经活动的参与［10］。有研究表明，对大鼠脑突触体的研究发现酒精对于γ-氨基丁酸(GABA)及Glu 摄取都有急性抑制作用，且对Glu摄取的抑制作用较GABA 的还要强。Asp 和Glu 是公认的EAAs，两者在中枢神经系统内的分布和作用相互交叉，两者都通过NMDA 受体来发挥作用。本实验中也发现急性酒精中毒时大鼠海马DG 区细胞外液的Glu，Asp 含量增加。

甘氨酸(Gly)作为IAAs 介导着脊髓及脑干的快抑制性突触传递，对感觉与运动进行抑制性调控。但近年来研究发现Gly 在CNS 中具有抑制与兴奋双重作用［11，12］。在中枢神经系统，Gly 主要是通过变构改变易化NMDA 受体对兴奋性氨基酸效应。因此，Gly 对NMDA 受体具有正性变构调节作用，是NMDA 受体必需的协同激动剂(coagonist)［13］，Gly受体拮抗剂能有效减轻神经元的继发性损害。本实验发现急性酒精中毒大鼠海马DG 区内Gly 含量增高，表示Gly 在急性酒精中毒时起到Glu 的协同激动剂作用，故我们可推测急性酒精中毒大鼠海马DG 区中有Glu 和Gly 两种氨基酸类神经递质的共同参与。

双氢麦角碱是一种α 肾上腺素能受体拮抗剂，具有扩张脑血管、改善脑组织微循环的作用。据文献报道双氢麦角碱对血管性痴呆、急性脑缺血性脑血管病、糖尿病性周围神经病变、帕金森病等有一定的疗效。王伟斌等［14］研究发现双氢麦角碱能改善脑缺血再灌注损伤模型小鼠海马的谷氨酸递质系统功能，进而提高了其学习、记忆成绩。关于双氢麦角碱对急性酒精中毒的影响报道很少，本实验发现双氢麦角碱成功干预了急性酒精中毒大鼠海马DG 区细胞外液Asp、Glu 和Gly 含量的增高。其具体机制尚不清楚，我们推测双氢麦角碱通过抑制急性酒精中毒时大鼠海马神经元末梢Asp、Glu 和Gly 的释放，对急性酒精中毒造成的脑损伤有一定的保护作用。

［1］Marczinski CA，Fillmore MT.Acute alchol tolerance on subjective intoxication and simulated driving performance in binge drinkers［J］.Psychol Addict Behav，2009，23(2):238 -247.

［2］张文玲，文亚男.酒精暴露与中枢神经系统的损伤［J］.河南大学学报(医学版)，2013，32(4):286.

［3］Tsai G，Gastfiend DR，Coyle JT.The glutamatergic basis of human alcoholism［J］.Am J Psychiatry，1995，152:332 -340.

［4］Khisti RT，VanDoren MJ，O’Buckley T，et al.Neuroactive steroid 3 alpha-hydroxy-5 alpha-pregnan-20-one modulates ethanol induced loss of righting reflex in rats［J］.Brain Res，2003，980(2):255 -265.

［5］Bliss TV，Lomo T.Longlasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the performance path［J］.J Physiol，1973，232(2):331 -56.

［6］Paxinos G，Waston C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.New York:Academic Press，1986.60 -69.

［7］Jin QH，Ueda Y，Ishizuka Y，et al.Cardiovascular changes induced ba central hypertonic saline are accompanied by glutamate elease in awake rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2001，281(4):1224 -1231.

［8］Yang X，Criswell HE，Simson P，et al.evidencefora selective effect of et-hanol on NMDA responses:Ethanol affects a subtype of the ifenprodil sensitive NMDA receptor［J］.J Phsrmacol Exp Ther，1996，278(1):114 -124.

［9］Gillessen T，Budd SL，Lipton SA.Excitatory amino acid neurotoxincity［J］.Adv Exp Med Biol，2002，513(1):3 -40.

［10］诸秉根，郑慧敏.乙醇对大鼠大脑皮质突触体高亲和摄取谷氨酸的急性效应［J］.中国临床神经科学，1999，7(3):143 -146.

［11］Johnson JW，Ascher P.Glycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons［J］.Nature，1998，7，325(5):529 -531.

［12］Degtyarenko AM，Kaufman MP.Bicuculline and strychnine suppress the mesencephalic locomotor region-induced inhibition of group III muscle afferent input to the dorsal horn［J］.Neuroscience，2003，118(3):779 -788.

［13］Siegal G.Basic Neurochemistry.5thed［M］.New York:Raven press，1994.367 -399.

［14］王伟斌，宋春风.喜得镇对脑缺血再灌注小鼠的行为及海马兴奋性氨基酸受体表达的影响［J］.临床神经病学杂志，2005，18(3):193 -195.