应用组织芯片技术检测胃癌组织中Lgr5和CD44的表达

刘元华，　樊祥山，　恽　艳

论著

应用组织芯片技术检测胃癌组织中Lgr5和CD44的表达

刘元华，樊祥山，恽艳

【摘要】目的研究胃癌组织中Lgr5和CD44的表达水平及其临床病理意义。方法应用组织芯片和免疫组织化学技术检测南京市鼓楼医院及江苏省肿瘤医院2005年1月至2008年12月胃癌手术切除标本273例胃癌组织中的Lgr5和CD44蛋白表达，并应用统计学方法分析Lgr5和CD44的表达水平与胃癌各种临床病理特征的关系及两者相关性。结果Lgr5在胃癌组织中表达与肿瘤pTNM分期有关(P<0.05)，与肿瘤分化程度、浸润程度、脉管侵犯及淋巴结转移情况无关(P>0.05)。CD44在胃癌组织中的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、pTNM分期均无关(P>0.05)。Lgr5和CD44的表达在胃癌组织中无相关性(P>0.05)。Logistic回归分析，Lgr5及CD44高表达、肿瘤分化及pTNM分期等均与胃癌预后不良有关。单因素分析，胃癌组织中Lgr5及CD44表达、肿瘤分化程度、pTNM分期、脉管侵犯等均与预后相关。多因素分析进一步证实，胃癌组织中Lgr5及CD44表达、肿瘤分化程度及pTNM分期等均与预后相关。结论Lgr5、CD44高表达是胃癌预后不良的标志，可以作为独立的预后因子。在胃癌中，检测Lgr5、CD44的表达可以作为判断胃癌患者预后的有效手段之一。

【关键词】胃癌；肿瘤干细胞；Lgr5蛋白；CD44蛋白；组织芯片

胃癌(gastric cancer，GC)是最常见的胃肠道肿瘤之一，其死亡率位居癌症死亡率前列，而且很大一部分患者在确诊时就已经进入晚期，至今还没有一种可靠的标记物能在早期就筛查出患癌高风险人群。近年来一个全新的理论肿瘤干细胞理论，成为当前肿瘤研究的热点，这个理论认为：在原发性肿瘤组织中存在着极少量一种细胞亚群，这种细胞亚群具有自我更新、多向分化和无限增殖的潜能，这个亚群就是肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)，肿瘤干细胞被认为是肿瘤生长、转移、复发的根源[1]。Lgr5是G蛋白耦联受体家族中的一员，最近研究结果显示，Lgr5可以作为胃癌肿瘤干细胞标记物[2]。CD44作为一种粘附分子，可以通过跨膜糖蛋白的方式介导细胞间或细胞与基质间的相互作用，在细胞的粘附、血管的形成和肿瘤的浸润和增殖中发挥重要作用，CD44也被作为是胃癌的肿瘤干细胞标志物[3]。在胃癌中，Lgr5和CD44表达与胃癌的临床病理因素及预后的相关性尚不甚清楚，胃癌组织中Lgr5和CD44表达的相关性也不明确。本研究将应用组织芯片及免疫组化来研究肿瘤干细胞标记物Lgr5和CD44在胃腺癌中的表达，并分析二者与胃癌临床病理特征和预后的关系以及相关性，旨在从干细胞相关标志角度研究胃癌发生、发展及预后，干细胞相关标志与临床病理特征和预后的关系，以期为胃癌的临床诊断提供新线索，为以干细胞标志为靶点的靶向治疗提供新思路。

1资料与方法

1.1一般资料收集南京市鼓楼医院及江苏省肿瘤医院2005年1月至2008年12月胃癌手术切除标本273例，其中男性182例(66.7%)，女性91例(33.3%)，年龄22~83岁，中位年龄62岁。TNM分期按照2010年第七版AJCC分期，末次随访时间为2012年11月30日，其中167例存活，患者随访时间3~81个月。所有入组胃癌患者术前均未进行放疗和化疗。

1.2主要试剂Lgr5兔抗人单克隆抗体购自Lifespan Biosciences公司；CD44鼠抗人单克隆抗体购自Zymed Laboratories公司。

1.3组织芯片构建复习所有患者的全部HE切片，确定有代表性的病变部位并在相应的蜡块上做好标记。应用组织微阵列打孔仪(购自美国Beecher instrument公司)在空白蜡块打孔，然后在蜡块的标记部位穿刺与孔大小相同的蜡柱，准确放入空白蜡块的小孔中，依次按序操作。每个病例重复取点3次，以获得较好的代表性。制作完成的组织芯片蜡块4 μm连续切片50张，置于-20 ℃储存。

1.4免疫组化染色测定依照EnVision试剂盒说明书行免疫组化染色。PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化结果由两位富有经验的高年资病理医师通过双盲法独立评估。

1.5免疫组化结果评判根据肿瘤细胞染色强度进行评分：无色为0；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，76%~100%为4分。按照染色强度评分与阳性细胞百分比评分的乘积决定最终染色结果，总分为0~12 分：其中0分记为0，即阴性；1~3 分记为1+，即弱阳性(低表达)；4~7 分记为2+， 8~12分记为3+，2+以上为强阳性(高表达)。Lgr5以细胞膜或细胞质出现棕黄色染色为阳性，CD44以细胞膜出现棕黄色染色为阳性。

1.6统计分析数据统计分析采用SPSS 16.0 统计软件包处理。采用χ2检验和Fisher’s检验及Spearman等级相关分析进行。患者的生存数据进行Kaplan-Meier法分析，并绘制生存曲线，应用log-rank检验差异性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2结果

2.1Lgr5和CD44在胃癌组织中的表达由于掉片，11例标本被剔除，故273例胃癌中有Lgr5检测结果的是262例，胃癌组织中Lgr5表达与肿瘤pTNM分期相关(P<0.05)，而与其他临床病理因素如性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、脉管侵犯及淋巴结转移无相关性(P>0.05)，见表1。

由于掉片，35例标本被剔除，故273例胃癌中有CD44检测结果是238例，胃癌组织中CD44表达与临床病理因素性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移情况、pTNM分期均无相关性(P>0.05)，见表1。

表1　Lgr5和CD44表达与胃癌临床病理特征的关系

2.2CD44及Lgr5表达在胃癌中的相关性分析对CD44及Lgr5表达进行Spearman等级相关分析，结果表明，273例胃癌标本中，CD44及Lgr5表达在胃癌中不存在相关性(r=-0.012，P=0.861)

2.3胃癌死亡危险因素Logistic回归分析应用Logistic回归分析胃癌死亡危险因素，结果表明，胃癌不良预后(死亡)与肿瘤分化程度、pTNM分期、Lgr5及CD44高表达相关，而与患者性别及年龄无关，详见表2。

2.4胃癌的单因素、多因素生存分析及Kaplan-Meier生存分析各种临床病理因素、CD44及Lgr5的表达水平与预后的单因素分析显示，肿瘤的预后与分化程度、pTNM分期、脉管侵犯、Lgr5高表达及CD44高表达相关(P<0.05)。多因素分析显示，肿瘤预后与分化程度、pTNM分期、Lgr5高表达及CD44高表达相关(P<0.05)(见表3)。患者的生存数据进行Kaplan-Meier法分析，log-rank检验显示，Lgr5及CD44的高表达水平组生存期显著短于中表达水平组及低水平表达组，Lgr5及CD44的中表达水平组生存期显著短于低水平表达组(均P<0.05)(见图1、图2)。

表2　胃癌患者死亡危险因素Logistic回归分析

表3　胃癌的单因素、多因素生存分析

图1　胃癌组织Lgr5表达的Kaplan-Meier生存曲线

图2　胃癌组织CD44表达的Kaplan-Meier生存曲线

3讨论

目前肿瘤最新研究观点认为：在肿瘤中存在少量的肿瘤干细胞，这些肿瘤干细胞具有自我更新无限增殖的能力，促进癌细胞的产生，正是肿瘤干细胞导致肿瘤的发生，是肿瘤耐药和复发的最主要原因之一。因此，对这些肿瘤干细胞的早期发现以及针对其进行的靶向治疗可能在癌症的早期诊断及治疗中具有重要的作用。Lgr5是Wnt信号途径的靶基因，属于7次螺旋跨膜糖蛋白激素受体类，Lgr5被认为是小肠[4]、大肠[4]及胃[5]等组织器官的干细胞标志，免疫组化证实，在肝癌[6]、结直肠癌[7]、卵巢癌[7]、基底细胞癌[8]及食管癌[9]等恶性肿瘤中高表达，并且与肿瘤发生、进展及预后相关。Takahashi等[10]研究发现，Lgr5mRNA高表达者更易发生区域淋巴结转移及远处转移，TNM分期更晚。本研究应用胃癌组织芯片技术进行免疫组化检测，发现胃癌组织中Lgr5表达与肿瘤pTNM分期相关(P<0.05)，pTNM分期晚者Lgr5表达水平高，而与其他临床病理因素如肿瘤分化程度、浸润深度、脉管侵犯及淋巴结转移无相关性(P>0.05)。Logistic回归分析胃癌危险因素表明，胃癌肿瘤分化程度、pTNM分期、Lgr5高表达均与不良预后(死亡)相关(P<0.05)。各种临床病理因素及Lgr5的表达水平与单因素分析显示，肿瘤分化程度、pTNM分期、脉管侵犯及Lgr5高表达均与预后相关(P<0.05)。多因素分析显示，肿瘤分化程度、pTNM分期及Lgr5高表达均与预后相关(P<0.05)。将患者的生存数据进行Kaplan-Meier法分析，log-rank检验显示，Lgr5的高表达水平组生存期显著短于中表达水平组及低水平表达组，Lgr5的中表达水平组生存期显著短于低水平表达组(P<0.05)。这些结果表明，干细胞标志Lgr5高表达是胃癌预后不良的标志，可以作为独立的预后因子。在胃癌中，检测Lgr5的表达可以作为判断胃癌患者预后的有效手段之一。

CD44分子是一种细胞黏附分子，其功能是介导淋巴细胞的归巢、淋巴细胞向炎症部位和黏膜相关淋巴组织归位、粘附细胞外基质等，CD44被认为是一种肿瘤干细胞标志[11]。CD44的高表达是胃癌的不良预后因子[12]。本研究应用胃癌组织芯片进行免疫组化检测CD44的表达，胃癌组织中CD44表达与临床病理因素如性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润程度、淋巴结转移情况、pTNM分期均无相关性(P>0.05)。Logistic回归分析胃癌危险因素，结果表明，胃癌肿瘤分化程度、pTNM分期及CD44高表达均与不良预后(死亡)相关(P<0.05)。各种临床病理因素及CD44的表达水平与预后的单因素分析显示，肿瘤分化程度、pTNM分期、脉管侵犯及CD44高表达均与预后相关(P<0.05)。多因素分析显示，肿瘤分化程度、pTNM分期及CD44高表达均与预后相关(P< 0.05)。患者的生存数据进行Kaplan-Meier法分析，log-rank检验显示，CD44的高表达水平组生存期显著短于中表达水平组及低水平表达组，CD44的中表达水平组生存期显著短于低水平表达组(P<0.05)。这些结果表明，干细胞标志CD44高表达是胃癌预后不良的标志，可以作为独立的预后因子，这与先前Doventas等[12]的报道一致。

本研究结果表明，Lgr5和CD44的表达无相关性(P<0.05)，我们推测，这可能表明Lgr5和CD44在胃癌肿瘤干细胞中并不同时表达，它们可能是胃癌肿瘤干细胞不同发育阶段的标志。本研究表明Lgr5及CD44的高表达为胃癌的不良预后因子，Lgr5及CD44的高表达可能成为胃癌患者术后进行辅助化疗的一个重要指标。目前对于Lgr5或CD44参与胃癌发生发展的机制还尚不明确，但胃癌中LGR5与CD44的高表达普遍存在，且与不良预后相关。深入研究Lgr5与CD44的功能以及它们的调节机制，将可能更好地对肿瘤的复发和转移做出预测，更好地指导临床治疗，有助于开发以胃癌肿瘤干细胞为靶点的肿瘤治疗新方法。

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Detection of Lgr5 and CD44 expression in gastric cancer using tissue microarraysLIUYuanhua1,FANXiangshan2,YUNYan3(1.DepartmentofInternalMedicine,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China；2.DepartmentofPathology,NanjingDrumTowerHospital,Nanjing210009,China；3.Maternalandchildhealthfamilyplanningservicecenter,Wujing,Changzhou213159，China)

Correspondingauthor:YUNYan,E-mail：shiningliu0108@126.com

Abstract：ObjectiveTo study the expression levels of Lgr5 and CD44 and the clinicopathological significances in gastric cancer tissue.MethodsTissue microarray and immunohistochemical staining was used to detect the expression of Lgr5 and CD44 in 273 cases of patients who had undergone gastrectomy for gastric adenocarcinoma. The correlation between Lgr5 and CD44 expression as well as the clinicopathological characteristics were analyzed using statistical method.ResultsLgr5 expression was associated with advanced pathological TNM stage(P=0.025). Lgr5 expression was not associated with poorly differentiated histology, invasion depth, lymph node metastasis and lymphatic invasion(P>0.05). CD44 expression was not correlated with clinicopathological features(P>0.05). Lgr5 expression was not correlated with CD44 expression(P>0.05). High Lgr5 expression，high CD44 expression，poorly differentiated histology and advanced pathological TNM stage were strong predictors of death in logistic regression analysis. Both Lgr5 expression and CD44 expression were associated significantly with poor overall survival in univariate analysis(P<0.05). Furthermore, on the basis multivariate analysis, Lgr5 and CD44 were independent markers of poor prognosis, along with pathological TNM stage and histologic grade(P<0.05).ConclusionsLgr5 expression and CD44 expression might be useful markers of poor prognosis in gastric cancer.

Keywords：Gastric cancer；Cancer stem cells;Lgr5;CD44;Tissue microarrays

[收稿日期：2015-09-17][本文编辑：李庆]

文章编号：1674-4136(2015)06-0341-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.06.001

通讯作者：恽艳，女，研究方向：肿瘤病理学，E-mail：shiningliu0108@126.com

基金项目：国家自然科学基金(No. 81101815)
作者单位： 210009江苏南京，江苏省肿瘤医院内科(刘元华)；210008江苏南京，鼓楼医院病理科(樊祥山)；213159江苏常州，常州武进区妇幼保健计划生育服务中心(恽艳)
第一作者： 刘元华，男，副主任医师，研究方向：肿瘤内科治疗，E-mail：yuanhualiu02@hotmail.com