大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及其与JNK信号通路关系

樊向文，　张　勇，　席　量，　李尚东

论著

大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及其与JNK信号通路关系

樊向文，张勇，席量，李尚东

【摘要】目的探讨大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7的促凋亡作用及其与JNK信号通路的关系。方法应用倒置显微镜观察人乳腺癌细胞MCF-7的生长情况，MTT法检测大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响，用流式细胞仪检测细胞凋亡，应用Western blot和免疫组织化学法检测JNK信号蛋白及其下游促凋亡蛋白AP-1的表达。结果大黄素可降低人乳腺癌细胞MCF-7增殖能力，具有时间依赖性和浓度依赖性。大黄素作用于人乳腺癌细胞MCF-7后，出现明显的早期凋亡现象(P<0.05)。不同浓度大黄素处理人乳腺癌细胞MCF-7后，均可引起JNK和JNK下游信号分子AP-1表达增强 (P<0.05)。结论大黄素可降低人乳腺癌细胞MCF-7增殖能力，促进早期凋亡，可使人乳腺癌细胞MCF-7表达JNK和AP-1增强，促进人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡。大黄素通过活化JNK信号转导途径抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖、促进凋亡。

【关键词】大黄素；乳腺癌；MAPK；JNK；AP-1

恶性肿瘤是一种体细胞无限制性地克隆扩增所致的疾病，寻找能够抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的药物已成为肿瘤治疗干预的切入点。中草药在肿瘤治疗方面有着很大的优势，已逐渐成为抗肿瘤药物研制开发的热点。某些中药具有抗乳腺癌作用，且具有对正常细胞损伤小的优点。大黄素是我国传统中草药，具有如抗炎、抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏等多种生物活性作用[1]。以往研究表明，大黄素对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，如人卵巢癌细胞、非小细胞肺癌、人慢性髓细胞性白血病细胞、胰腺癌等[2-7]。大黄素具有诱导多种肿瘤细胞的凋亡效应及细胞毒潜能，大黄素对不同的细胞系抑制生长的机制有所不同，其诱导凋亡的信号转导途径主要有Bax-Caspase途径、ERK途径、PKC途径、Fas途径及ROS途径等[8-9]。

然而大黄素对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制和促凋亡作用与JNK/AP-1信号通路关系如何，未见报道，尚为此我们进行了以下研究。

1材料与方法

1.1材料

人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)，大黄素(纯度≥98%)，JNK抑制剂AS601245。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)，常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中贴壁培养。接种细胞进入对数生长期后，加入不同浓度大黄素(20、40、60、80 μmol/L)，作用24 h后检测各种观察指标。

1.2.2细胞增殖抑制率测定(MTT法)取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)，用RPMI1640培养液配成1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的大黄素(20、40、60、80 μmol/L)，培养48 h后用MTT法检测细胞活性。即：培养结束后，每孔加入8 μl MTT(5 mg/ml)继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入100 μl DMSO，摇床振荡10 min，待生成的甲瓒结晶完全溶解后，以630 nm为参比波长，测定570nm处的吸光值，计算细胞增殖抑制率，每组设3个平行孔。试验设计每处理重复 4 次，结果为4组数据的平均值，抑制率(IR) =(1-样品组OD值/对照组OD值)×100%，即：细胞增殖抑制率=(1-A570样品/A570空白)×100%。

1.2.3AnnexinV-FITC/PI法细胞凋亡分析取对数生长期人乳腺癌细胞MCF-7 3 ml，按1×105个细胞/孔种于6孔板，24 h后依据上述IC50值分组加药，即阴性对照组(0 μmol/L)和加药组(20、40、60、80 μmol/L)和JNK抑制剂AS601245组，每组设3个复孔，继续培养48 h后在流式细胞检测仪上进行检测。

1.2.4Western blot法检测JNK、AP-1及内参β-actin蛋白表达取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7，调整细胞密度为2×105/ml，接种于6孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，设空白对照组、大黄素20 μmol/L组、大黄素40 μmol/L组、大黄素80 μmol/L组、大黄素40 μmol/L﹢20 μmol/L AS601245组，继续培养48 h后收集细胞，用Brad-ford蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白浓度测定。

1.2.5JNK免疫细胞化学染色及图像分析采用S-P法进行JNK免疫细胞化学染色，取人乳腺癌细胞MCF-7爬片，按常规方法用4%多聚甲醛固定，DAB呈色，显微镜下控制反应，出现阳性结果后终止反应。中性树胶封片后光学显微镜观察。每组随机取5张免疫组织化学切片，在高倍镜下，每张切片随机取5个视野，应用Image-pro plus 5.0图像分析软件进行OD值的测量。

1.3统计学处理

采用SPSS15.0统计软件包，对计量资料进行方差齐性检验。方差齐性者，用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MCF-7细胞形态学观察

倒置显微镜下见正常对照组(图1)细胞生长旺盛，多呈椭圆形或多角形，细胞体饱满、完整，细胞核较大，呈卵圆形且多居中。用大黄素处理人乳腺癌细胞MCF-7后随着药物大黄素浓度的增大、作用时间的延长，表现为细胞体积缩小，活细胞数减少，胞质回缩，细胞间不再连接成片，有的细胞黑色颗粒增多(图2～5)。

2.2MTT法MCF-7细胞增殖力的测定结果

与对照组比较，大黄素各浓度组的人乳腺癌细胞MCF-7增殖能力均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。不同浓度大黄素在不同时间段对MCF-7细胞的抑制率随大黄素浓度的加大或作用时间的延长，对MCF-7细胞的抑制率逐渐增大，同一时间80 μmol/L大黄素组为最明显。同一浓度以作用72 h和96 h时最明显(表1)。然而，若先用20 μmol/L JNK抑制剂AS601245孵育30 min后，再加入大黄素40 μmol/L处理，并不能明显抑制MCF-7细胞的增殖，与对照组比较细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。

抑制率(IR) =(1-样品组OD值/对照组OD值) ×100%

表1　大黄素对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7

注：★与对照组比较，P<0.05；△与24 h比较，P<0.05。

2.3大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响

不同浓度的大黄素作用于人乳腺癌细胞MCF-7 48 h后，MCF-7细胞出现明显的早期凋亡现象，并且这种凋亡现象有明显的浓度依赖性关系，随大黄素浓度升高，细胞凋亡率也升高，组间比较有显著差异(P<0.05)。然而，若先用20μmol/L JNK抑制剂AS601245处理细胞，再加入40 μmol/L大黄素对MCF-7细胞凋亡率增加不明显，与对照组比较，MCF-7细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05，表2和图7)。

表2　大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响

注：与其他组比较★P<0.05；B、C、D、E 4组间两两比较，均P<0.05。

2.4大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7 JNK蛋白表达的影响

人乳腺癌细胞MCF-7培养细胞爬片，经S-P法免疫细胞化学染色观察和图像分析，结果表明：与空白对照组比较，大黄素各剂量组MCF-7细胞 JNK表达存在显著性差异(P<0.05)，随着大黄素浓度的增大，JNK表达(OD值)逐渐增强(P<0.05)。如果对MCF-7细胞行20 μmol/L AS601245预处理，MCF-7细胞JNK表达并不增强(图8～10及表3所示)。

表3　大黄素对体外培养MCF-7细胞JNK

分组OD值对照组(A)6.03±0.3510μmol/L大黄素组(B)6.83±0.39★20μmol/L大黄素组(C)8.06±0.37★★40μmol/L大黄素组(D)10.12±0.45★★80μmol/L大黄素组(E)12.37±0.52★★20μmol/LAS601245+40μmol/L大黄素组(F)6.21±0.38

注：与对照组相比较，★P<0.05， ★★P<0.01。

2.5不同剂量大黄素对MCF-7细胞AP-1表达的影响

Western blot发现：与对照组比较，10 μmol/L大黄素即可引起人乳腺癌细胞MCF-7中JNK下游信号分子AP-1在表达升高(P<0.05)，并且随着大黄素浓度的增大，AP-1表达也逐步增强(P<0.05)，与JNK表达相一致。若用20μmol/L AS601245预处理MCF-7，MCF-7细胞AP-1表达并不增强(图11)，这与MCF-7细胞凋亡率一致。

图11　不同剂量大黄素对MCF-7细胞AP-1表达的影响

3讨论

3.1大黄素抗肿瘤、抗乳腺癌作用

大黄素(Emodin)(1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌)属单蒽核类1，8-二经基蒽醌衍生物，具有如抗炎、抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏等多种生物活性作用[1]。近几年来，对蒽醌类大黄素等性能及药理的研究，已经扩展到肿瘤治疗领域，逐步探究其诱导肿瘤细胞凋亡的机理，正在成为一个重要的研究方向，并取得了一定进展。在此基础上，我们主要讨论其诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导通路。

大量研究表明，大黄素对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用，如人卵巢癌细胞、非小细胞肺癌、人慢性髓细胞性白血病细胞、胰腺癌等[2-7]。大黄素表现出强大的抗肿瘤效应，可能是由于其抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤血管生成和侵袭、转移，增加肿瘤的化疗敏感性和逆转肿瘤多药耐药，减轻化疗药物毒副反应等多种机制，其诱导凋亡的信号转导途径主要有Bax-Caspase途径、ERK途径、PKC途径、Fas途径及ROS途径等[8-10]，大黄素可在一定程度上逆转肿瘤细胞的多药耐受，具有抑制核苷转运的作用，大黄素能抑制多种恶性肿瘤细胞生长并诱导凋亡，其机制是诱导肿瘤细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，然后凋亡调控基因Bcl-2表达水平降低、Bax表达水平升高，导致线粒体内cytochromec释放入胞浆，进而激活Caspase 2、3、9的活性，如此通过线粒体途径诱导细胞凋亡[11-12]。本研究在体外实验应用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果表明：用大黄素处理人乳腺癌细胞MCF-7后随着药物大黄素浓度的增大、作用时间的延长，表现为细胞体积缩小，活细胞数减少，胞质回缩，细胞间不再连接成片，有的细胞黑色颗粒增多。大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。不同浓度大黄素在不同时间段对MCF-7细胞的抑制率随大黄素浓度的加大或作用时间的延长，对MCF-7细胞的抑制率逐渐增大，说明大黄素可降低人乳腺癌细胞MCF-7增殖能力，促进早期凋亡。

3.2大黄素诱导MCF-7细胞凋亡与JNK信号通路关系

丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是细胞外信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者，从细胞外刺激作用于细胞至细胞出现相应的生物学效应，其间通过了MAPK信号转导通路多级蛋白激酶的级联反应。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是MAPK家族的一个主要成员，其诱导活化与细胞凋亡反应存在密切关系。研究表明，激活JNK信号通路是抑制肿瘤细胞增殖，引起肿瘤细胞凋亡主要分子机制[13]。JNK信号途径可被多种细胞应激因素激活，如紫外线辐射、过氧化氢作用、DNA损伤、热休克和化学治疗药物的应用等[12]。活化的JNK通过对其信号通路的下游底物转录因子c-Jun、ATF-2、Elk-1等的磷酸化，促进基因的表达及新蛋白质的合成，新生蛋白质可能作用于细胞凋亡途径的某一环节而促进或引起细胞凋亡[14-15]。近年大量研究表明，在肿瘤的发生与发展中，JNK依赖性的凋亡可能受到抑制，提示JNK信号途径成分是潜在的抑癌基因，因此，JNK信号通路是一个干预治疗的潜在分子靶点。Altiok等[16]研究也报道：JNK信号途径调节雌二醇-诱导的激素依赖性人乳腺癌细胞凋亡，JNK信号通路激活，促进乳腺癌细胞凋亡，有助于乳腺癌治疗。然而，大黄素可否抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，鲜见报道，且机制不清。周颉等[15]研究表明：大黄素对体外培养的乳腺癌细胞株的多药耐药有明显的逆转作用，同时还下调了ERCC1的表达水平，低毒安全，有值得深入研究的价值。Dhanasekaran等[17]研究了p-JNK 在乳腺浸润导管癌中的表达，结果显示p-JNK表达水平在乳腺浸润性导管癌中增强。JNK信号通路诱导活化与细胞凋亡反应存在密切关系，磷酸化JNK与磷酸化Bcl-2的表达呈正相关，JNK与Bcl-2同属一个信号通路，且具有上下游关系的JNK与Bcl-2的激活可以抑制肿瘤的淋巴道转移。Huang等[18]研究发现：Hela细胞M-RIPsiRNA组与对照组比较，其迁移与侵袭能力明显减低，但M-RIP的这种作用是通过JNK通路的激活而产生的，即JNK通路的激活使M-RIP的表达增加，从而影响肿瘤细胞的侵袭能力。本研究显示：大黄素对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。不同浓度的大黄素作用于人乳腺癌细胞MCF-7 48 h后，MCF-7细胞出现明显的早期凋亡现象，并且这种凋亡现象有明显的浓度依赖性关系，随大黄素浓度升高，细胞凋亡率也升高；若先用20 μmol/L JNK抑制剂AS601245处理细胞，再加入40 μmol/L大黄素对MCF-7细胞凋亡率增加不明显。与空白对照组比较，大黄素各剂量组MCF-7细胞 JNK表达存在显著性差异，随着大黄素浓度的增大，JNK表达(OD值)逐渐增强；如果对MCF-7细胞行20 μmol/L AS601245预处理，MCF-7细胞JNK表达并不增强。说明大黄素可能通过抑制JNK信号转导途径抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进凋亡。

3.3核转录因子活化蛋白1(AP-1)与JNK信号通路关系

核转录因子活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)是位于JNK下游介导促细胞凋亡效应的关键信号蛋白分子，能够将细胞外刺激信号传导至细胞核，并激活具有AP-1结合位点的靶基因转录和表达[19]。JNK是一种能够激活AP-1的关键上游蛋白激酶，可通过磷酸化Fos、Jun蛋白从而增强AP-1的转录激活活性。郝一等[20]研究表明：As2O3可诱导JNK持续性高强度表达，转录因子AP-1的转录激活活性上调，认为JNK/AP-1途径是介导As2O3诱导乳腺癌细胞凋亡反应的重要信号通路。AP-1的活性主要受MAPKs家族调节，该家族有多个亚家族，其中在细胞信号转导中发挥重要作用的有3种：JNK，p38及ERK。在不同的组织和细胞中，AP-1受不同的激酶调控。AP-1作为转录调节蛋白，能够将细胞外刺激信号传导至细胞核，并激活具有AP-1结合位点的靶基因的转录和表达[21]。殷咏梅等[22]研究显示，在MCF-7细胞中，TNF-α通过JNK信号通路激活AP-1家族成员，而对其他两条MAPKs通路没有明显影响。本研究结果显示：大黄素即可引起人乳腺癌细胞MCF-7中JNK下游信号分子AP-1在表达升高，并且随着大黄素浓度的增大，AP-1表达也逐步增强，与JNK表达相一致。若用20 μmol/L AS601245预处理MCF-7，MCF-7细胞AP-1表达并不增强，这与MCF-7细胞凋亡率一致。进一步证明大黄素通过抑制JNK信号转导途径抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进凋亡。

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The Emodin inducted human breast cancer MCF-7cell apoptosis and activated JNK signal transduction pathwaysFANXiangwen，ZHANGYong，XILiang，LIShangdong.(DepartmentofSurgicalOncology,BaogangHospital,Baotou014010,China)

Correspondingauthor:FANXiangwen,E-mail：fanxiangwenbill@163.com

Abstract：ObjectiveTo explore the Emodin impact on human breast cancer MCF-7 cell proliferation and apoptosis, as well as related to JNK signal pathway. Method Application of inverted phase contrast microscope observed human breast cancer MCF-7 cell growth in vitro, proliferation of MCF-7 cell was detected by MTT method, and apoptosis of MCF-7 cell was detected by flow cytometer.Using Western blot and immunohistochemistry methods detected expressions of JNK and activator protein 1(AP-1) related apoptosis. ResultsThe Emodin could reduce human breast cancer MCF-7 cell proliferation vary with time and the concentration respectively, and there had a statistically significance (P<0.05). The Emodin reduced human breast cancer MCF-7 cell early apoptosis phenomenon, in a concentration dependence way, with a statistically significant (P<0.05).Different concentration of Emodin could enhance expression of JNK signal downstream of AP-1 gene related apoptosis in human breast cancer MCF-7 cell, and there had a statistically significance (P<0.05). ConclusionsThe Emodin could reduce proliferation capacity of human breast cancer MCF-7 cell in vitro, promote early apoptosis, enhance expressions of JNK and AP-1 related apoptosis in human breast cancer MCF-7 cell. The Emodin could inhibit human breast cancer MCF-7 cell proliferation, promote apoptosis by activation of JNK signal transduction pathways.

Keywords：Emodin; Breast cancer;MAPK;JNK;Activator protein 1(AP-1)

[收稿日期：2015-06-15][本文编辑：李筱蕾]

文章编号：1674-4136(2015)06-0346-06

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.06.002

通讯作者:樊向文,E-mail:fanxiangwenbill@163.com

基金项目：内蒙古自然基金项目(2013SM1168)
作者单位： 014010内蒙古包头，内蒙古包钢医院肿瘤外科
第一作者： 樊向文，男，硕士研究生，主治医师，研究方向：乳腺癌及消化道肿瘤的诊治，E-mail：fanxiangwenbill@163.com