3种鱼类弹状病毒荧光定量环介导等温扩增检测方法的建立

陈珍容，陈进会，陈 洵，唐大运，石 磊，颜其贵*

(1.四川农业大学动物医学学院，四川温江 611130；2.东莞出入境检验检疫局，广东东莞 523072；3.广州迪澳生物科技有限公司，广东广州 510012)

鱼类弹状病毒(Fish rhabdovirus)是一类引起鱼及其他水生动物致死性和流行性病害的重要病毒病原。迄今报道的鱼类弹状病毒已有十几种，目前最主要的、危害最大的几种分别为鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、病毒性出血败血症病毒(Viral haemorrhagic septicemia virus,VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)等。SVCV 常在鲤科鱼特别是在鲤鱼中流行，主要导致鲤鱼科鱼类大规模暴发鲤春病毒血症[1]。VHSV 是一种能够感染各种年龄鲑鳟鱼和各种海鱼的致死性的、全身性传染病病毒，引发病毒性出血性败血症[2]。IHNV 是引发传染性造血器官坏死病的病原，主要感染鲑、鳟鱼类。这3 种病毒引起淡、海水养殖的多种经济鱼类发生流行性病害，给世界水产养殖业造成严重的经济损失，目前尚缺乏有效控制方法[3-4]。

对这3 种病毒通常采用RT-PCR 方法检测；也有采用传统环介导等温扩增(LAMP)方法进行肉眼观察检测，本研究分别建立了这3 种鱼类弹状病毒的RT-LAMP 快速检测方法，结合恒温荧光检测仪Deaou-308C，可以通过收集荧光信号来判断样品是否发生扩增并进行结果判读，操作简便，特异性和敏感性高，广泛适应于基层现场检测及大规模鱼病监测。

1 材料和方法

1.1 病毒株及实验动物 SVCV、VHSV 和IHNV均由迪澳生物科技有限公司保存；传染性胰坏死病毒(IPNV)核酸由北京出入境检验检疫局张利锋惠赠；狗鱼弹状病毒(PFRV)核酸、牙鲆弹状病毒(HRV)核酸由深圳出入境检验检疫局国家水生动物疫病检测重点实验室提供。斑马鱼购自东莞某出口观赏鱼养殖场。

1.2 主要试剂及仪器 AMV 反转录酶购自TaKaRa公司；病毒RNA 提取试剂盒、琼脂糖DNA 回收试剂盒以及质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Bst DNA polymerase large fragment 购自NEB 公司；SYBR Green I 荧光染料购自北京鼎国生物工程公司；SVCV 荧光RT-PCR 检测试剂盒、VHSV 荧光RT-PCR 检测试剂盒、IHNV 荧光RT-PCR检测试剂盒均购自北京海森通生物科技有限公司；RT-LAMP、RT-PCR 引物由TaKaRa 公司合成。恒温荧光检测仪Deaou-308C 为广州迪澳生物科技有限公司产品；荧光PCR 仪7500 为美国ABI 公司产品。

1.3 引物的筛选 参照文献[3-5]的设计，筛选出扩增SVCV-1、VHSV-2 及IHNV-3 效率最优的引物(表1)。

表1 3 种弹状病毒的引物序列Tabel 1 RT-LAMP primer sequences used in the study

1.4 病毒RNA的提取 IHNV、SVCV、VHSV 为RNA 病毒，按照病毒RNA 提取试剂盒说明书提取病毒RNA。使用UV-1800 DNA/RNA 浓度测定仪测定样品A260nm/A280nm比值，计算RNA 浓度。按下列公式计算其浓度：RNA 原液浓度(ng/μL)=OD260nm×稀释倍数×40，根据浓度计算其拷贝数[6]。

拷贝数(拷贝/μL)=[6×1023(拷贝/μL)×RNA 浓度(g/μL)]/[质量MW(g/mol)]

MW=RNA 碱基数(bp)×330 daltons/bp

1.5 RT-LAMP检测条件的优化及方法的建立RT-LAMP 扩增初步按如下体系进行：FIP 和BIP 各1.6 μmol/L，F3 和B3 各0.2 μmol/L，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，10 mmol/L(NH4)2SO4，10 mL/L Tween20，1 mol/L 甜菜碱，1.6 mmol/L dNTP，8 U Bst 大片段DNA 聚合酶，2 U AMV，0.5×SYBR Green I 1 μL，2 μL RNA，ddH2O 补足体积到25 μL。采用经过筛选的LAMP引物，对Mg2+、dNTP、Bst 大片段DNA 聚合酶、反应温度和反应时间进行优化，以建立RT-LAMP的检测方法。

采用方阵法分别对Mg2+浓度(0 mmol/L～10 mmol/L)、dNTP 浓度(1.0 mol/L～1.8 mol/L)、Bst 大片段DNA 聚合酶[0.5 μL(4 U)、1.0 μL(8 U)、1.5 μL(12 U)]、反应温度(57 ℃、60 ℃、63 ℃、66 ℃、69 ℃)及反应时间(20 min～60 min)进行优化。

1.6 特异性试验 分别提取SVCV、VHSV、IHNV以及HRV、PFRV、IPNV 的RNA 2 μL 作为特异性反应的模板，设无模板阴性对照，采用建立的3 种鱼类弹状病毒LAMP 检测方法进行RT-LAMP 反应，于63 ℃运行40 min，验证其特异性，利用恒温荧光检测仪Deaou-308C 观察反应结果。

1.7 灵敏度试验 采用病毒RNA 提取试剂盒提取病毒RNA，将提取后的模板进行定量后，分别进行10 倍梯度稀释，每个稀释度取2 μL 进行RT-LAMP，以100 倍稀释的病毒RNA 模板作为阳性对照，设无模板阴性对照，在恒温荧光检测仪Deaou-308C 上进行RT-LAMP，63 ℃运行40 min 以确定灵敏度。

以同样稀释度的RNA 作为一步法RT-PCR 模板，参照试剂盒要求的模板、引物和反应体系，在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上进行试验。25 μL 反应体系包括：RT-PCR 反应液15 μL，酶混合物1.0 μL，RNA 模板9.0 μL，反应程序：反转录42 ℃30 min；92 ℃3 min；92 ℃15 s、53 ℃15 s、60 ℃30 s，40 个循环；在第3 阶段每次循环的60 ℃退火延伸时收集荧光，根据荧光曲线和Ct 值判断结果。

1.8 人工感染试验

1.8.1 接种试验 取24 条健康正常的斑马鱼，随机平均分为3 个人工感染组和一个阴性对照组，每组6 条。适应性饲养2 d 后，分别向3 个感染组中投入SVCV、VHSV 和IHNV 病毒悬液，使其浓度维持106TCID50左右，3 d 后，每个感染组的斑马鱼再进行腹腔注射108TCID50左右的病毒悬液20 μL进行强化，继续饲养3 d 后，取每条鱼的内脏和脑组织。

1.8.2 斑马鱼样品检测 取斑马鱼组织脏器(内脏及脑)2 g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加5 mL PBS 混匀，2 000 r/min 离心10 min 取上清转入无菌离心管中，采用病毒RNA 提取试剂盒提取RNA。分别利用本研究的SVCV、VHSV、IHNV 引物，在恒温荧光检测仪Deaou-308C 上进行检测。

同时采用荧光定量RT-PCR 检测试剂盒进行检测，比较检测结果。

2 结果

2.1 RNA模板浓度 经测定，SVCV RNA 的浓度为2.4 ng/μL(约4.0×109拷贝/μL)；VHSV RNA 的浓度为4.5×10-2ng/μL(约5.4×107拷贝/μL)；IHNV RNA 的浓度为0.36 ng/μL(约4.3×108拷贝/μL)。

2.2 反应体系的优化 经反应条件的优化，确定Mg2+浓度在4 mmol/L～6 mmol/L；dNTP 浓度为1.4 mmol/L～1.6 mmol/L；Bst 大片段DNA 聚合酶至少为1 μL(8 U)；反应时间为40 min；反应温度为63 ℃。将混合物放置于恒温荧光检测仪Deaou-308C 反应孔中，63 ℃恒温反应40 min 进行检测。

2.3 特异性试验 分别提取SVCV、VHSV、IHNV以及HRV、PFRV、IPNV RNA 2 μL 作为特异性反应的模板，采用初步组装的3 种鱼类弹状病毒LAMP 检测试剂盒进行RT-LAMP 反应。结果显示，仅SVCV RNA 模板组、VHSV RNA 模板组、IHNV RNA 模板组发生特异性扩增，HRV、PFRV、IPNV及阴性对照未出现扩增(图1)，表明建立的3 种鱼类弹状病毒LAMP 检测方法的引物针对SVCV、VHSV、IHNV 具有良好的特异性。

图1 RT-LAMP 引物特异性反应Fig.1 RT-LAMP Primer specificity

2.4 灵敏度试验 将拷贝数为4.0×109拷贝/μL SVCV RNA、5.4×107拷贝/μL VHSV RNA、4.3×108拷贝/μL IHNV RNA 进行100～10-6稀释，每个浓度梯度分别取2 μL 进行RT-LAMP 扩增，63 ℃运行40 min(图2A、2C、2E)。同时利用荧光定量RT-PCR 检测试剂盒对同样的模板进行检测(图2B、2D、2F)。

结果表明，各10 倍系列稀释模板出峰时间逐步延后，RT-LAMP 和荧光定量RT-PCR 均能够检测到10-5SVCV、10-3VHSV、10-4IHNV，即拷贝数分别为4.0×104拷贝/μL、5.4×104拷贝/μL、4.3×104拷贝/μL(图2)，表明RT-LAMP 与荧光定量RT-PCR 的灵敏度一致。

图2 RT-LAMP 灵敏度试验Fig.2 The sensitivity test of RT-LAMP

2.5 人工感染样品检测结果 采用本研究建立的检测方法在恒温荧光检测仪Deaou-308C 恒温反应检测24 个样品，同时与SVCV RT-PCR 检测试剂盒、VHSV RT-PCR 检测试剂盒、IHNV RT-PCR 检测试剂盒的检测24 个样品结果的比较(表2)。结果表明，本研究初步组装的RT-LAMP 检测试剂盒与市售的一步法RT-PCR 试剂盒在检测人工感染的斑马鱼样品结果上并无差异，同时也表明3 种病毒引物间无交叉反应的现象。

表2 临床样品检测结果的比较Table 2 The comparison of clinical samples test results

3 讨论

2010 年Lucchi 等首次报道了利用德国QIAGEN公司生产的ESE-Quant tube scanner 系统进行LAMP扩增的数据采集，并且将该方法用于疟疾的快速检测[7]。本研究中荧光定量PCR 灵敏性强，高于普通PCR 100 倍[8]，但由于设备和技术的要求很高，很难普及使用，而国内广州迪澳生物科技有限公司自主研发的国内首台恒温荧光检测仪Deaou-308C，该仪器具有轻便易携带，操作简单方便的特点，十分适用于现场快速检测和基层推广，以及进出口口岸检疫部门的疫病监测。本研究采用全程闭管检测，避免了传统LAMP 反应因开盖导致的核酸扩增的气溶胶污染，杜绝了假阳性结果的产生。

本研究建立的恒温荧光定量RT-LAMP 反应体系包括一对内引物(FIP、BIP)、一对外引物(F3、B3)以及一对环引物(LOOPF、LOOPB)，环状引物通过与茎环结构杂交，启动链置换DNA 的合成，环状引物结合的区域在哑铃状结构的5' 端的成环区即F2 和F1 之间(或B2 和B1 之间)，这样，所有的茎环DNA 或者与内引物结合，或者与环状引物杂交结合，从而把反应时间缩短到15 min 以内即可辨别阴阳性，表明荧光检测比浊度检测更为灵敏快捷。特异性试验结果显示，亲缘较近的SVCV、VHSV和IHNV 之间无交叉反应，并且与亲缘较远的弹状病毒HRV、PFRV、IPNV 也无交叉反应，表明筛选的引物特异性较好，能够满足检测需求。灵敏度试验结果显示，能够检测到3 种弹状病毒模板浓度拷贝数分别为4.0×104拷贝/μL、5.4×104拷贝/μL、4.3×104拷贝/μL，表明该方法的灵敏度较高。

近年来，随着LAMP 检测技术深入研究，应用领域越来越广泛，人类疾病的快速检测，动植物检疫和食品安全检测广泛使用该技术[9-10]。相对于大多数研究者实光LAMP 检测方法采用浊度仪，史秀杰等利用GENIE Ⅱ荧光扩增仪建立的传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光RT-LAMP 检测方法，能够检测出78.4 fg RNA，比常规RT-PCR 灵敏度高100 倍，更为便捷[11]。姜侃等建立了3 重LAMP 方法检测食品中沙门氏菌、单增李氏特菌和葡萄球菌，达到了LAMP 一次检测多种病原高通量更为省时的检测方法[12]。本研究之初，也试图建立3 重RT-LAMP 一次检测3 种鱼类弹状病毒的高通量方法，考虑到一种病毒就需要3 对引物，3 种病毒引物间的干扰问题，同时恒温荧光检测仪Deaou-308C 实时荧光检测平台，无法达到多道荧光检测的要求，需要继续改进和深入研究。

3 种鱼类弹状病毒快速LAMP 检测方法的建立，为基层动检和实验室现场检测，特别是口岸鲜活鱼类快速通关检测提供了良好的技术手段。

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