牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定

周跃辉，朱远茂，任建乐，严 昊，王雪枝，马 磊，史鸿飞，薛 飞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001)

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由IBR 病毒(IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎和上呼吸道炎症为主要特征[1]。病毒原发感染后在三叉神经节建立潜伏感染、不定期向外排毒，给该病的清除带来了困难。该病呈世界性分布，对养牛业造成了严重的经济损失[2]。

IBRV 又名牛疱疹病毒1 型(Bovine herpesvirus 1，BoHV-1)，属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科水痘病毒属。IBRV 基因组由双链DNA 组成，编码约70 种蛋白，病毒颗粒囊膜上的11 种糖蛋白在致病性和免疫反应方面起重要作用[3]。gD 是IBRV 的主要结构蛋白之一，由417 个氨基酸组成，糖基化后分子量约为69 ku，该蛋白能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥重要作用[4]。本研究采用纯化的IBRV 免疫BALB/c小鼠制备了一株针对IBRV gD 的单克隆抗体(MAb)，对其反应性与特异性及抗原表位进行了鉴定，为进一步研究gD 蛋白奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞、质粒及实验动物 IBRV Bartha Nu/67 株、牛副流感病毒3 型(BPIV-3)SD0835株、牛腺病毒3 型(BAV-3)、牛肾细胞系(MDBK)、骨髓瘤细胞SP2/0 细胞、pET-30a、pGEX-6P-1 均由本实验室保存；6 周龄～8 周龄的BALB/c 小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 蛋白纯化试剂盒(His-bind Purification Kit)购自Invitrogen 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、HT、HAT、PEG4000、FITC 标记羊抗鼠IgG(IgG-FITC)、山羊抗鼠IgGHRP 均购自Sigma 公司；MAb 亚类鉴定试剂盒购自Invitrogen 公司；DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白预染Marker 购自Thermo公司。

1.3 引物设计及合成 根据IBRV 的gD 基因序列(NC_001847)，采用Primer Premier 5 设计一对引物，5'-ATCGGATCCCCGATGCCGCGATACA-3'(Bam HⅠ)/5'-CTCAAGCTTGGGGTGCGTGATGGC-3'(Hin d Ⅲ)用于扩增gD 蛋白基因的106 bp～1 044 bp 编码序列，引物由哈尔滨博仕生物合成。

1.4 IBRV的gD蛋白的诱导表达及纯化 提取IBRV Bartha Nu/67 株基因组DNA，PCR 扩增gD 基因。PCR 产物经纯化后克隆于pET-30a 载体中，构建重组表达质粒pET-gD，并将其转化BL21(DE3)表达菌中，1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h，收集菌体。经SDS-PAGE 电泳分析重组蛋白表达情况并进行western blot 鉴定。菌体超声波破碎后，经蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白。

1.5 动物免疫 采用经超速离心纯化后的IBRV 免疫BALB/c 小鼠，200 μg/只。首免使用弗氏完全佐剂乳化，颈部皮下多点注射，二免和三免使用不完全佐剂乳化，腹腔多点注射。免疫间隔时间为两周，三免5 d 后鼠尾采血测定效价。融合前3 d 不加佐剂加强免疫一次，200 μg/只。

1.6 间接ELISA的建立 以纯化后的gD 蛋白作为包被抗原、免疫BALB/c 小鼠三免后血清作为阳性对照、未免疫BALB/c 小鼠血清作为阴性对照，经方阵滴定，取阳性值接近1.0，阴性值小于0.2 且P/N 最大时的抗原包被量和血清的稀释度作为抗原及对照血清的最佳工作浓度。

1.7 细胞融合及阳性杂交瘤的筛选 免疫小鼠脾淋巴细胞与对数生长期的SP2/0 细胞按照常规方法进行细胞融合，通过已建立的间接ELISA 筛选阳性杂交瘤细胞株。对初步筛选的阳性孔进行克隆纯化，直至获得单一的阳性克隆杂交瘤细胞系。

1.8 MAb生物学特性的鉴定

1.8.1 MAb 亚类鉴定 按照抗体亚类试剂盒说明书进行MAb 亚类鉴定。

1.8.2 腹水制备及其效价和中和活性测定 常规方法制备腹水，SP2/0 细胞腹水作为阴性对照，采用间接ELISA 检测其效价。腹水从1∶4 开始倍比稀释，加入等体积含300 TCID50/0.1 mL 的IBRV 培养液，37 ℃作用4 h，接种于铺满单层MDBK 细胞的96 板培养板中，每个稀释度4 个重复，每孔100 μL，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中。48 h 后观察细胞病变(CPE)，120 h 后判定结果，以能够中和2 孔或2孔以上的血清最高稀释度为中和效价。

1.8.3 MAb 的western blot 分析 超速离心纯化后IBRV 和纯化后gD 重组蛋白经SDS-PAGE 后转移到硝酸纤维膜上，5 %脱脂乳4 ℃过夜封闭，加入1∶1 000 倍稀释的HRP 标记MAb，室温1 h，洗涤后加入DAB 显色液孵育，出现明显条带后终止反应。

1.8.4 间接免疫荧光(IFA)检测 将IBRV、BAV-3、BPIV-3 分别接种MDBK，待CPE 达到50 %时弃去培养液，经无水乙醇固定20 min，以MAb(1∶500)为一抗，兔抗鼠IgG-FITC(1∶100)为二抗，进行IFA检测。

1.9 MAb针对抗原表位的鉴定及分析

1.9.1 MAb 抗原表位鉴定 将gD 蛋白基因106 bp～1 044 bp 序列(aa36～aa348)分为相互重叠的片段，设计引物，上下游分别引入Bam HⅠ/XhoⅠ位点，目的片段克隆于表达载体pGEX-6P-1 中构建重组质粒，转化感受态表达菌BL21，诱导表达的重组GST 多肽与MAb 进行western blot 验证，对阳性区段逐步进行截短表达，完成抗原表位初步定位。为精确鉴定抗原表位，以上下游引物退火形成目的片段的方式设计引物从初步定位的肽段的N 端和C 端分别以1 个氨基酸残基为单位逐步递减，通过MAb与表达的GST 融合蛋白的western blot 分析，确定MAb 识别的抗原表位。

1.9.2 抗原表位分析 选取多个IBRV 分离株及相关反刍动物疱疹病毒gD 蛋白氨基酸序列进行比对分析，以了解其保守性。

2 结果

2.1 gD蛋白的原核表达、鉴定及纯化 将gD 基因的106 bp～1 044 bp 编码序列克隆至pET-30a 载体，转化BL21(DE3)表达菌，诱导后进行SDSPAGE 分析及western blot 鉴定。SDS-PAGE 分析结果表明gD 重组蛋白呈部分可溶表达，分子量约为52 ku，上清中蛋白经纯化效果较好。Western blot 表明在52 ku 处有一特异的反应条带，表明表达产物具有良好的反应性(图1)。

2.2 MAb的制备及初步鉴定 常规细胞融合后经过3 次克隆纯化后获得一株稳定分泌MAb 的阳性杂交瘤细胞株，命名为1G3。经MAb 亚类鉴定为IgG1/κ。腹水效价为1∶12 800。病毒中和试验结果表明其腹水的病毒中和效价为1∶32。

2.3 MAb的western blot鉴定 取纯化后IBRV 及重组gD 蛋白经SDS-PAGE，与HRP 标记1G3 进行western blot 鉴定，以未接毒MDBK 细胞作为阴性对照，结果表明，MAb 1G3 与IBRV 和重组gD 蛋白反应，不与MDBK 细胞对照反应，目的条带大小均符合预期(图2)。

图1 表达的重组gD 蛋白的SDS-PAGE 及western blot 分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of the recombinated gD protein expression

图2 MAb 1G3 的western blot 鉴定Fig.2 The identification of MAb 1G3 by western blot

2.4 MAb的IFA鉴定 将IBRV、BAV-3、BPIV-3分别接种MDBK，以MAb 1G3 为一抗，兔抗鼠IgG-FITC 为二抗，进行IFA 检测。结果表明MAb 1G3 与IBRV 反应，不与BAV-3、BPIV-3 等牛呼吸道病毒反应(图3)。

图3 MAb 1G3 的IFA 鉴定Fig.3 The specificity identification of MAb 1G3 by IFA

2.5 MAb 1G3的抗原表位鉴定

2.5.1 抗原表位初步鉴定 将gD 蛋白aa36～aa348氨基酸逐步进行截短与GST 标签进行融合表达，产物经SDS-PAGE 分析及western blot 鉴定，初步将MAb 1G3 的抗原表位定位于D211 和D212 的交叉部位，共计7 位氨基酸(aa259～aa265)(图4)。

2.5.2 抗原表位的精确定位 分别从初步定位的7个氨基酸残基的N 端和C 端进行逐个氨基酸的截短直至不发生反应为止，结果表明当缺失第1 位氨基酸时，MAb 反应活性下降，缺失第2 位氨基酸及第7 位氨基酸时，MAb 1G3 与之不反应，因此判定7肽259EESKGYE265为MAb 1G3 的抗原表位(图5)。

图4 抗原表位的初步鉴定Fig.4 The preliminary identification of antigen epitope

图5 抗原表位的精确定位SDS-PAGE 及western blot 分析Fig.5 SDS-PAGE and western blot analysis of the precise location of antigen epitope

2.6 抗原表位分析 分析多个IBRV 分离株及其他相关反刍动物疱疹病毒的gD 蛋白氨基酸序列，进行序列比对，结果表明该抗原表位在IBRV 各分离株以及BoHV-5 中均保守，在其他反刍动物疱疹病毒如山羊疱疹病毒1 型(CpHV-1)、鹿疱疹病毒1 型(CvHV-1)及驼鹿疱疹病毒1 型(ElkHV-1)中差异较大(图6)。

3 讨论

图6 抗原表位保守性分析Fig.6 Conservative analysis of antigenic epitope of IBRV gD

MAb 在病原的生物学特性和抗原性研究、检测诊断以及预防治疗等方面具有重要的应用价值[5]。IBRV 是一种重要的牛呼吸道传染病病原，在初次感染牛体后呈潜伏感染状态[6-8]。IBRV gD 蛋白可以诱导中和抗体的产生，在病毒吸附和侵入细胞的过程中发挥着重要作用，是病毒复制必需蛋白[9-10]。分别用gB、gC、gD 免疫鼠和牛，结果显示gD 与其它糖蛋白相比，可诱导更高而持久的细胞免疫。王延辉等利用原核表达系统截短表达了IBRV 的gD 蛋白，重组蛋白呈部分可溶性表达[3]；祖立闯等用纯化的gD 蛋白初步建立了检测IBRV 血清抗体的间接ELISA[4]。本研究利用pET-30a 表达了IBRV 的gD蛋白，重组蛋白呈部分可溶性表达，约为52 ku。纯化后的重组gD 蛋白具有良好的反应性。以超离纯化IBRV 免疫小鼠，用纯化的重组gD 蛋白作为检测抗原，经常规融合后获得了一株具有中和IBRV 活性的MAb 1G3。应用肽扫描技术对其中和表位进行了精确鉴定，对IBRV 的不同分离株进行gD 蛋白序列分析表明，该抗原表位在IRBV 不同分离株及Bo-HV-5 中保守，BoHV-5 按照之前的分类是BoHV-1的一个亚型，两者氨基酸同源性较高，共用很多抗原表位[11-12]。在进行抗原表位精确鉴定的过程中，发现若缺少第259 位氨基酸，MAb 1G3 的western blot 反应性大大下降，但仍然存在，ELISA 试验表明缺失第259 位氨基酸后其OD 值由2.0 降至0.8，后续的试验表明，在259EESKGYE265的N 和C 端再增加1 个和2 个氨基酸残基，其反应活性不变，表明7 肽259EESKGYE265是MAb 1G3 识别的真实抗原表位。本研究为IBRV 的糖蛋白gD 的结构和免疫学特性及IBRV 致病性的深入研究奠定了基础。

[1]朱远茂，王海燕，薛飞，等.牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立[J].中国兽医科技，2005，35(12)：959-963.

[2]王海燕，朱远茂，薛飞，等.牛传染性鼻气管炎病毒gE 基因的截短克隆与表达[J].中国预防兽医学报，2006，28(3)：289-293.

[3]王延辉，薛飞，朱远茂，等.牛传染性鼻气管炎病毒gD 蛋白的截短表达与活性检测.中国预防兽医学报，2007，29(11)：865-869.

[4]祖立闯，朱远茂，王延辉，等.牛传染性鼻气管炎病毒重组gD 蛋白间接ELISA 的建立与应用.中国预防兽医学报，2008，30(7)：537-543

[5]文雪霞，陈化兰，熊永忠，等.抗原表位鉴定方法的研究进展.中国畜牧兽医，2012，39(7)：66-69.

[6]Jones C.Herpes simplex virus type 1 and bovine herpesvirus 1 latency[J].Clin Microbiol Rev,2003,16:79-95.

[7]Jones C,Chowdhury S.A review of the biology of bovine herpesvirus type 1(BHV-1),its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex,and development of improved vaccines[J].Anim Health Res Rev,2007,8:187-205.

[8]Jones C,Chowdhury S.Bovine herpesvirus type 1(BHV-1)is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2010,26:303-321.

[9]Alves D L,Pereira L L F,van Drunnen L.Bovine herpesvirus glycoprotein D.a review of its structural characteristics and applications in vaccinology[J].Vet Res,2014,45:111.

[10]Baranowski E,Keil G,Lyaku J,et al.Structural and functional analysis of bovine herpesvirus 1 minor glycoproteins[J].Vet Microbiol,1996,53:91-101.

[11]Julien T,Véronique K,Benoit M,et al.Ruminant alphaherpesviruses related to bovine herpesvirus 1[J].Vet Res,2006,37:169-190.

[12]Abdelmagid O,Minocha H,Collins J,et al.Fine mapping of bovine herpesvirus-1(BHV-1)glycoprotein D(gD)neutralizing epitopes by type-specific monoclonal antibodies and sequence comparison with BHV-5 gD[J].Virology,1995,206:242-253.