牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

马建伟，吉佳乐，刘亚静，李春明，冯思源，李能章，彭远义

(西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 400715)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)为一种革兰阴性菌，可以引起多种动物疾病，如禽霍乱、猪萎缩性鼻炎以及牛出血性败血症等[1-2]。Pm具有多种血清型，其中牛源A 型Pm 主要引起牛肺炎，B 型Pm 主要引起牛出血性败血症[3-4]，给养牛业造成了严重的经济损失。

目前用于预防牛源Pm 疾病的疫苗只有针对B型Pm 的传统疫苗，这类疫苗对不同血清型交叉保护弱[3]。开展交叉保护性抗原的筛选，对新型疫苗的研究具有重要意义。研究表明，在多株Pm 血清型中ompA、ompH、plpE[5]、pm0979、P6 以及pfhB 6 种基因编码的蛋白能够诱导较高的抗体水平，提供较好的保护性[6]，但这些蛋白中哪些能够提供交叉保护性作用还未见报道。本研究以这6 种重组蛋白作为研究对象，对其交叉保护性进行研究，筛选并鉴定对A 和B 型Pm 均具有交叉保护性的抗原。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及实验动物 牛源A 型Pm CQ2株、B 型Pm CVCC450 株、大肠杆菌(E.coli)感受态DH5α、BL21 及Rosetta 株均由本实验室保存；A 型和B 型Pm 阳性牛血清由本实验室制备保存；18 g～25 g 清洁级昆明小鼠购自重庆中药研究所。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；核酸及蛋白质标准分子量Marker 购自Fermentas 公司；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Omega公司；弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂购自Sigma公司；碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗牛IgG(IgG-AP)购自鼎国生物技术有限公司；BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒购自Beyotime 公司。

1.3 引物设计与合成 根据本实验室Pm CQ2 株相关基因测定序列，设计6 组特异性引物(表1)，由上海Invitrogen 公司合成。因本实验室Pm CQ2 株基因组的plpE 基因为截短表达设计，因此设计了两对引物对plpE 基因进行拼接扩增。

1.4 目的基因扩增及重组表达质粒的构建 以Pm CQ2 株基因组DNA 为模板，分别扩增pm0979、P6、pfhB、ompH、ompA 以及plpE 基因。回收相应扩增产物，将其克隆于pET-30a 或pET-32a 载体中，分别构建重组表达质粒，并由上海Invitrogen 公司测序鉴定。

表1 目的基因扩增引物Table 1 The primer of target gene

1.5 重组蛋白的纯化及鉴定 分别将构建的重组质 粒 pET-plpE、pET-pm0979、pET-ompH、pETompA 和pET-P6 转化至BL21(DE3)感受态细胞，以终浓度为1 mmol/L 的IPTG 37 ℃诱导4 h；将重组质粒pET-pfhB 转化至Rosetta 感受态细胞，以终浓度为1 mmol/L 的IPTG 30 ℃过夜诱导表达。将表达的重组蛋白经Ni-NTA superflow cartridge His 亲和层析柱纯化，并将纯化后的重组蛋白依次采用6 M 尿素、4 M 尿素、2 M 尿素、1 M 尿素、PBS 透析复性。

分别以A 型和B 型Pm 阳性牛血清作为一抗(1:8)，以抗牛IgG-AP 为二抗(1:15 000)，以BCIP/NBT 显色，对重组蛋白进行western blot 鉴定。

1.6 小鼠攻毒保护性试验 将140 只雌性小鼠随机分为14 组，每组10 只，以复性的纯化重组蛋白分别与等量的弗氏佐剂乳化，100 μg/只皮下免疫小鼠，首免7 d 后进行二次免疫，每种重组蛋白免疫2 组小鼠，同时设未免疫的对照组。采集二免21 d 后小鼠尾静脉血并分离血清，参考文献[7]的方法，利用间接ELISA 方法测定二免后小鼠体内血清抗体的产生情况。并于二免21 d 后采用剂量为2 LD50的Pm CQ2 株(4.4×105cfu)、Pm CVCC450 株(2.96×104cfu)腹腔接种攻毒。

2 结果

2.1 目的基因扩增及重组质粒的鉴定 以Pm CQ2株基因组为模板，采用PCR 分别扩增pm0979、P6、pfhB、ompH、ompA 及PlpE 基因。结果显示各目的片段分别约为400 bp、450 bp、600 bp、1 050 bp、1 000 bp 及950 bp，与预期大小相符(图1)。将纯化的PCR 产物克隆于pET-30a 或pET-32a 载体中，分别构建重组表达质粒，测序结果显示，重组表达质粒均构建正确。

图1 目的基因的PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 重组蛋白的纯化及鉴定

2.2.1 重组蛋白的纯化 将构建的重组质粒分别转化至BL21 或Rosetta 感受态细胞。重组菌株经IPTG诱导表达后，纯化并进行SDS-PAGE 检测。结果显示，重组蛋白rPfhB(27 ku)、rOmpA(43 ku)、rOmpH(44 ku)、rPlpE(43 ku)、rP6(34 ku)以及rPm0979(21 ku)的分子量大小与预期相符(图2)，表明各基因均正确表达了相关重组蛋白。

图2 重组蛋白的SDS-PAGE 检测Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins

2.2.2 重组蛋白的免疫活性鉴定 对获得的重组蛋白的表达形式进行鉴定，结果显示各重组蛋白均以包涵体形式表达，分别对其复性后进行western blot鉴定。结果显示，当以A 型Pm 阳性牛血清为一抗时，重组蛋白均能够与阳性牛血清发生反应，出现了明显的免疫特异性条带，表明重组蛋白均具有良好的反应原性(图3)。

2.3 免疫小鼠血清中抗体的产生情况 分别以复性后的重组蛋白rOmpH、rOmpA、rP6、rPm0979、rPlpE 以及rPfhB 免疫小鼠后，采用间接ELISA 试验检测二免后小鼠血清中抗体产生情况。结果显示，重组蛋白rOmpH、rPm0979 及rPlpE 抗体水平均处于较高水平，而对照组抗体始终维持较低水平(图4)，结果提示重组蛋白rOmpH、rPm0979 及rPlpE 可能会提供较好的保护性。

图3 重组蛋白western blot 鉴定结果Fig.3 Western blot analysis of recombinant proteins

图4 免疫小鼠血清抗体水平Fig.4 The assay of serum antibody in mice

2.4 小鼠攻毒保护性试验结果 各组实验小鼠于二免后21 d 以Pm CQ2 株(2 LD50)和Pm CVCC450 株(2 LD50)进行腹腔攻毒，各重组蛋白对小鼠的保护率结果见表2，结果表明重组蛋白rOmpH、rPm-0979、rP6 以及rPlpE 均具有交叉保护性作用，其中rPlpE的交叉保护性作用最强，对Pm CQ2 株的保护性达70 %，对Pm CVCC450 株的交叉保护性达40 %。

3 讨论

近年来，Pm 亚单位疫苗的开发主要集中在菌体表面抗原成分，Pm 表面抗原成分包括LPS、荚膜、外膜蛋白及丝状血凝素等，均与毒力机制密切相关[8]。目前，研究较多的Pm 外膜蛋白主要有OmpA、OmpH 等。OmpH 为Pm 菌体最主要的外膜蛋白，被认为是交叉保护应答中最主要的抗原[9]，可以诱导产生高水平的保护性抗体[10]；重组的OmpA蛋白能够诱导免疫反应，并产生较高的IgG 抗体[11]。同时，在疫苗开发中脂蛋白被认为是潜在的靶抗原，截至目前，只有少数Pm 脂蛋白被验证具有较好的免疫原性，如PlpE 和Pm0979，两者均可以作为巴氏杆菌亚单位疫苗候选抗原[12]，PlpE 重组蛋白能够对同源以及异源的Pm 产生不同程度的保护作用[13]；P6 样外膜蛋白基因非常保守，而且Kasten等研究表明P6 样外膜蛋白编码的蛋白具有反应原性[14]；另外，Pm 的突变株pfhB 的毒力已被证明被完全减弱[15]。因此，本研究选取以上表面抗原基因进行原核表达，并对其免疫保护特性进行研究。

表2 重组蛋白免疫小鼠对Pm CQ2、Pm CVCC450 株的保护率Table 2 Protection efficacy of recombinant proteins to mice against the challenge of bovine Pm CQ2 strain and Pm CVCC450 strain

本研究对牛源Pm CQ2 株ompA、ompH、plpE、pm0979、P6 以及pfhB 基因原核表达后，通过western blot 鉴定以及小鼠攻毒保护性试验，显示6 种抗原对A 和B 型Pm 提供了不同程度的保护性，其中重组蛋白rPlpE 表现出较高的交叉保护性作用，对A 型Pm 提供了高达70 %的保护率，同时，对B 型提供了40 %的保护率。本研究中重组蛋白rPfhB 对A 型Pm 的保护性比预期的低，其原因可能是由于本研究中pfhB 基因不是全长基因，但具体机制还需进一步研究。

目前，对于牛源Pm 交叉保护性因子研究较少，本研究中筛选的3 种交叉保护性因子ompH、plpE以及pm0979 能够在不同血清型的菌株之间产生较好的交叉保护性，可以作为后续开发融合蛋白疫苗的候选成分，为针对多种血清型Pm 的新型疫苗研发奠定了基础。

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