正交试验优选蕲蛇煎煮工艺

柴士伟，董改英，瞿晶田，王 然（天津中医药大学第一附属医院药学部，天津 300193）

蕲蛇之名首见于李时珍的《本草纲目》中，为蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥体，性甘，味咸，有毒，归肝经；具有祛风、通络、止痉的功效，用于治疗风湿顽痹、麻木拘挛、中风、半身不遂、抽搐痉挛、破伤风、麻风、疥癣等[1]。蕲蛇是我国传统名贵中药材之一，药用资源短缺，价格较高。2010 年版《中国药典》采用聚合酶链式反应法作为其鉴别方法，但对含量测定方法尚未涉及。笔者在本文中采用酸水解柱前异硫氰酸苯酯（PITC）衍生化的方法，建立蕲蛇中4种主要氨基酸的反相高液相色谱检测方法，并以这4种氨基酸的总含量为指标，对蕲蛇水煎煮工艺进行优化，以期较大程度地提取蕲蛇中有效成分，使这一宝贵的资源得到更合理的应用。

1 材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪、G1314B型紫外-可见检测器（美国安捷伦科技有限公司）；超声清洗器（杭州汇尔仪器设备有限公司）；AL104 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团有限公司）；氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；优普超纯水系统（西安优普仪器设备有限公司）。

1.2 药材、药品与试剂

蕲蛇样品[河北美威药业股份有限公司提供，批号：140201，产地：浙江；经我院主管药师李明老师鉴定为蕲蛇Agkistrodon acutus（Güenther）]；天冬氨酸对照品（批号：140624-200805，纯度：100%）、谷氨酸对照品（批号：140624-200805，纯度：99.5%）、L-羟脯氨酸对照品（批号：111578-200201，纯度：99.5%）、甘氨酸对照品（批号：140624-200805，纯度：100%）均来源于中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲醇和乙腈为色谱纯，PITC及其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dikma Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以0.1 mol/L醋酸钠溶液-乙腈（97∶3）为流动相A（用冰醋酸调节pH 至6.5），以乙腈-水（4 ∶1）为流动相B，梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：43 ℃；进样量：10 μl。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution programme

2.2 溶液的制备

2.2.1 4种氨基酸对照品贮备液的制备 精密量取4种氨基酸对照品置于量瓶中，用0.1 mol/L 盐酸溶液制备成每1 ml 分别含天冬氨酸212 μg、谷氨酸288 μg、L-羟脯氨酸332 μg、甘氨酸636 μg的混合对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取蕲蛇原药材，粉碎，精密称定，置于100 ml 圆底烧瓶中，加水，称定质量，回流提取加热（煎煮）一定时间，放冷，称质量，用水补足减失质量，重复煎煮1～3 次。精密量取提取液5 ml，置于10 ml 高温水解管中，加入6 mol/L 盐酸5 ml，混匀，充入氮气后密封，于150 ℃水解1 h，放冷，移入蒸发皿中，用10 ml水分次洗涤水解管，洗液并入蒸发皿中，水浴蒸干。残渣加0.1 mol/L 盐酸溶解，转移至10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 空白溶液制备 精密量取水5 ml，置于10 ml高温水解管中，取6 mol/L 盐酸溶液5 ml，按“2.2.2”项下方法自“充入氮气后密封，于150 ℃水解1h”起操作，即得。

2.2.4 PITC衍生物的制备 取上述空白溶液、4种氨基酸混合对照品贮备液和供试品溶液各0.4 ml，分别置于1.5 ml离心管中，加入0.1 mol/L PITC 的乙腈溶液0.2 ml、1 mol/L 三乙胺的乙腈溶液0.2 ml，漩涡混合30 s，室温放置1 h后，加入0.8 ml正己烷，涡旋混合30 s后，放置10 min，取下层溶液，滤过，即得。

2.3 系统适用性试验

在选定的色谱条件下分析，结果4种氨基酸衍生物峰与其他相邻峰分离度均大于1.5；按L-羟脯氨酸衍生物峰计算，理论板数均在4 000 以上。空白溶液、4 种氨基酸对照品和正交试验9号供试品衍生物的高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白溶液；B.4 种氨基酸对照品衍生溶液；C.供试品衍生溶液；1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.L-羟脯氨酸；4.甘氨酸Fig 1 HPLC chromatogramA.blank solution；B.reference solution of 4 kinds of amino acids by derivation；C.test solution by derivation；1.aspartic acid；2.glutamate；3.L-hydroxyproline；4.glycine

2.4 线性关系考察及氨基酸含量测定方法

分别精密吸取天冬氨酸等4 种氨基酸对照品贮备液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 ml，分别置于10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L盐酸至刻度，摇匀。按“2.2.4”项下衍生化方法处理后，分别吸取上述溶液10 μl注入液相色谱仪中，测定峰面积，以4种氨基酸对照品质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、相应峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到4种氨基酸的回归方程、相关系数及线性范围。而后按“2.2.4”项下衍生化方法对蕲蛇供试品溶液进行处理，测定各氨基酸衍生化峰面积，依据4 种氨基酸的回归方程，计算各氨基酸的含量。线性关系考察结果见表2。

2.5 精密度试验

取蕲蛇原药材，粉碎，过3号筛，精密称定0.30 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每次进样10 μl，重复进样6次，测定天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸、甘氨酸的峰面积，结果RSD分别为0.29%、0.20%、0.41%、0.86%（n＝6），表明本方法精密度良好。

表2 4种氨基酸的线性关系考察Tab 2 Linear relationship of 4 kinds of amino acids

2.6 稳定性试验

取蕲蛇原药材，粉碎，过3号筛，精密称定0.30 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别放置0、8、16、24、32、48 h时对供试品溶液进行衍生化，进样10 μl，测定天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸和甘氨酸的峰面积，其RSD 分别为1.80%、1.13%、0.48%、0.68%（n＝6），表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取蕲蛇原药材，粉碎，过3 号筛，精密称定0.30 g，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定样品中天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸和甘氨酸含量，结果分别为0.61%、1.05%、0.61%、1.72%，RSD分别为0.50%、0.81%、0.77%、1.06%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取蕲蛇原药材，粉碎，过3 号筛，精密称定0.15 g，共6 份，加入4种氨基酸对照品贮备液5 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，经衍生化后测定各氨基酸的含量，计算回收率。结果，天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸和甘氨酸的平均回收率分别为94.42%、93.62%、98.13%、96.18%，RSD 分别为3.27%、2.13%、2.20%、5.02%（n＝6）。结果表明，本方法准确度较好。

2.9 蕲蛇水煎煮工艺的优化

取蕲蛇原药材，粉碎，精密称定0.90 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定原药材中4种氨基酸的含量。以4种氨基酸的总含量为指标，对蕲蛇水煎煮工艺进行优化。根据预试验结果，选择煎煮次数、加热时间、加水量和药材粉碎粒度为4因素，各取3水平进行正交试验。因素与水平见表3，试验安排与结果见表4，方差分析见表5。

表3 因素与水平Tab 3 Factors and levels

通过上述正交试验结果及方差分析可以看出，煎煮次数、加热时间、加水量和粉碎粒度对4种氨基酸的煎出总量都有非常显著的影响。但是当加水量由50 ml增加到70 ml时，4种氨基酸的煎出总量却降低。因此，蕲蛇水煎煮的最优工艺为A3B3C2D3，即煎煮次数为3次、加热时间为60 min、加水量为50 ml、粉碎粒度为过6号筛。

据此，进行了蕲蛇水煎煮工艺验证试验。取蕲蛇样品，过6号筛，精密称定9.00 g，共3份，煎煮3次，加热时间为60 min，加水量为500 ml。按“2.2.2”项下方法自“补足减失质量”起操作制备供试品溶液。按此条件测得蕲蛇水煎煮液中天冬氨酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸和甘氨酸的平均提取含量分别为14.70、25.14、8.47、24.37 mg/g，提取总含量为72.68 mg/g，RSD为3.77%（n＝3）。3次验证试验提取出的4种氨基酸的总含量均较高，并且3次试验结果无显著性差异、重现性较好。

表4 正交试验安排与结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Arrangement and results of orthogonal tests（n＝3，mg/g）

表5 方差分析结果Tab 5 Results of variance analysis

3 讨论

蕲蛇为蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥体，具有祛风除湿、治疗风湿顽疾的药理作用[1]。现代药理学证明，蕲蛇具有抗炎镇痛的药理作用，能够缓解胶原诱导性关节炎模型大鼠的关节炎症状[2-3]，其作用机制为抑制肿瘤坏死因子（TNF）α、升高细胞白细胞介素（IL）10 水平[4]。丁兴红[5]将核苷类物质（尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿苷）作为指标进行检测，但未有文献报道此类物质具有抗炎镇痛的药理作用。进一步研究发现，蕲蛇发挥作用的有效成分为Ⅱ型胶原蛋白类成分[6]。2010 年版《中国药典》中没有收录蕲蛇含量测定的方法。笔者考虑到蕲蛇与阿胶中主要成分均为胶原蛋白，其水解后所得氨基酸相似[7-9]，因此参考了2010 年版《中国药典》（一部）阿胶项下的测定方法——柱前衍生化法，并参考文献[10-11]对该方法进行了部分优化。结果表明，建立的方法用于检测蕲蛇中水解氨基酸的准确度和重复性均较好，可作为蕲蛇质量控制的方法。

笔者针对蕲蛇样品的特点，应用加热回流的方法对蕲蛇进行提取，能够更好地模拟日常煎煮药材的过程；并在此基础上对蕲蛇水煎煮工艺进行了优化，使所得结果更具有实用价值。

目前医院销售的中药多为饮片，但目前有部分医院针对一些特殊患者（如儿童、老人）推出了煮散剂（粉末），此剂型可节省药材、方便患者。但药材粉碎后对有效成分的溶出有何影响？煎煮工艺如何变化？药液质量如何评价等？都需要加以比较及系统研究。因此，笔者在此研究思路下选取蕲蛇作为研究对象，拟在下一步研究中比较蕲蛇块和蕲蛇粉末煎煮后药液质量差异，以此来优选蕲蛇的最优煎煮工艺，以指导临床使用。故本试验结果主要是用于指导医院日常中药处方的煎煮，以节约药材、保证疗效，尚不涉及中药大生产。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：350.

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[4]张纪达，范永升，温成平，等.蕲蛇水提取物对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-10 的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（5）：1 407.

[5]丁兴红.HPLC法测定蕲蛇中核苷类成分的研究[J].浙江中医药大学学报，2011，35（6）：906.

[6]谷恒存，胡金波，丁志山，等.蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白对CIA大鼠的治疗作用[J].中华中医药学刊，2013，31（10）：2 207.

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[9]赵洁，左华丽.RP-HPLC法测定不同厂家阿胶中核苷类化合物的含量[J].中国药房，2012，23（32）：3 050.

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[11]程显隆，肖新月，邹秦文，等.柱前衍生化HPLC法同时测定阿胶中4 种主要氨基酸的含量[J].药物分析杂志，2008，28（12）：1 997.