白藜芦醇-泊洛沙姆188固体分散体的制备及其性能研究

任红暖，王晓丽，陈肖如，陈丽萍，周婷婷，高振珅，2#，宋兴良（.临沂大学药学院，山东 临沂 276005；2.临沂大学现代中药研究所，山东临沂 276005；3.临沂大学化学化工学院，山东临沂 276005；4.山东省资源与环境分析化学重点实验室，山东临沂 276005）

白藜芦醇（RES）是一种非黄酮类多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保护、神经系统保护以及延长低等生物寿命等多种生理活性[1]。RES 在水中的溶解度低，常用乙醇、二甲基亚砜等溶剂溶解，但使用这些溶剂制备的RES 溶液对体外培养的细胞和对体内细胞都会产生不利的影响。由于RES 溶解度低、生物利用度低、水溶液稳定性差，限制了其在制药领域中的应用[2]。目前，已有研究报道，将其制成纳米粒、包合物、改性葡聚糖结合物等来提高其溶解度、稳定性[2-4]。泊洛沙姆188（P188）是一种非离子型高分子表面活性剂，在药物制剂中主要用作乳化剂和增溶剂，也是常用的载体材料之一。笔者拟以P188为载体材料，制备白藜芦醇-P188固体分散体（RES-P188-SD），从而提高RES 的溶解度，改善RES 的溶出性能和抑菌性，达到增强药效的目的，以期为RES新制剂的开发及应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

TU-1810 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；S3400 扫描电镜（日本日立公司）；ZRS-8G 释放仪（天津鑫洲科技有限公司）；DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SW-CJ-2FD 净化工作台（上海龙跃仪器设备有限公司）；XFS-280A高压蒸汽灭菌锅（上海新丰医疗器械有限公司）；SPX-400B 生化培养箱（上海博讯实业有限公司）。

1.2 药品与试剂

RES 原料药（南京泽朗医药科技有限公司，批号：20141010，纯度：＞98%）；RES 对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111535-200502，纯度：≥98%）；P188（德国Basf 公司，批号：WPMG557C）；其余试剂均为分析纯。

1.3 菌种

大肠埃希菌ATCC 29523、金黄色葡萄球菌ATCC 29213由临沂大学现代中药研究所提供。

2 方法与结果

2.1 RES分析方法的建立

2.1.1 测定波长选择 取RES 对照品适量，用无水乙醇溶解并制备成适宜质量浓度的RES 对照品溶液；按处方比例称取空白辅料，用无水乙醇制备成适宜质量浓度的辅料对照溶液，0.45 μm 微孔滤膜滤过，在200～500 nm 波长范围内紫外扫描。结果，RES对照品溶液在305 nm波长处有最大吸收，且辅料在此处无干扰，故选择305 nm为测定波长。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称定干燥至恒质量的RES对照品0.01 g，置于100 ml 棕色量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，制备成质量浓度为0.1 mg/ml的RES对照品贮备液。分别量取RES对照品贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml棕色量瓶中，用无水乙醇稀释并定容至刻度，制备成质量浓度为0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/ml 的RES 对照品系列溶液。分别在305 nm 波长处测定吸光度（A），以A为纵坐标、质量浓度（c，mg/ml）为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程为A＝0.118 6c－0.017 7（r＝0.999 7，n＝5）。结果显示，RES 检测质量浓度线性范围为0.002～0.010 mg/ml。

2.1.3 精密度试验 量取质量浓度为0.006 mg/ml RES的对照品溶液，在305 nm波长处测定A，同日内连续测定5次，考察日内精密度；每日测定1 次，连续测定5 d，考察日间精密度。结果，日内和日间精密度的RSD分别为0.14%、0.75%（n＝5），表明该方法精密度良好。

2.1.4 方法回收率试验 量取对照品贮备液6、8、10 ml，各取3份，共9份，分别置于100 ml量瓶中，按照处方比例精密称取辅料并分别加入量瓶中，加入5 ml pH为6.8的磷酸盐缓冲液，再用无水乙醇定容至刻度，摇匀后，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得相应质量浓度的对照品溶液。于305 nm 波长处测定A，计算方法回收率。结果，平均回收率为100.5%（RSD＝0.57%，n＝9），表明该方法准确度较好。

2.2 RES-P188-SD的制备

称取RES 原料药1 g 于蒸发皿中，加无水乙醇适量，使其充分溶解。称取处方量的P188 于蒸发皿中，用乙醇溶解并与RES原料药混合均匀，于恒温水浴中挥干乙醇，置于60 ℃干燥箱中干燥，粉碎，过80目筛，即得。

2.3 RES和P188物理混合物的制备

按照最佳方案的药物与载体的质量比，分别精密称取RES原料药、P188于研钵中，混匀，过80目筛，即得。

2.4 溶解度的测定[5]

取过量的RES 原料药和RES-P188-SD 分别置于25 ml 具塞三角烧瓶中（避光），分别加入5 ml 蒸馏水，在温度为（25±1）℃下恒温振荡24 h，制成过饱和溶液。待达到溶解平衡后，取上清液用0.45 μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，用适量蒸馏水稀释后，采用紫外吸收法在305 nm波长处测定A，分别计算RES和RES-P188-SD在水中的溶解度。

2.5 溶出度测定

参照2010年版《中国药典》（二部）附录ⅩC项下溶出度测定第一法（篮法）测定溶出度[6]。将RES原料药、RES与P188的物理混合物和RES-P188-SD（相当于RES 原料药15 mg）分别均匀分散于温度为（37±0.5）℃、体积为900 ml、pH 6.8 的磷酸盐缓冲液中，设置转速为100 r/min，分别在5、10、15、30、60、90、120 min时通过玻璃管过滤器（0.45 μm微孔滤膜）定位定时吸取10 ml 溶出液（同时补充同温新鲜缓冲溶液10 ml），滤过。取续滤液5 ml，置于10 ml棕色量瓶中，放至室温，适当稀释后，于305 nm波长处测定A，计算累积溶出度。

2.6 单因素试验考察

2.6.1 熔融温度的考察 预试验中按照RES原料药与P188的质量比为1 ∶2制备RES-P188-SD，蒸发溶剂的温度分别设定在60、70、80、90 ℃。结果RES 收率（收率＝收得量/投料量×100%）分别为92.15%、89.50%、89.19%、89.82%。60 ℃时熔融时间较长，70 ℃时熔融速度较快，而80 ℃和90 ℃时熔融迅速，随温度的升高，熔融用时缩短，收率也有所降低。

2.6.2 药载比的考察 分别以RES原料药与P188的质量比为1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9，在70 ℃下熔融，制备RES-P188-SD，观察其性状并测定收率。结果显示，RES-P188-SD 干燥后呈暗黄胶态，表面泛油光；随着P188 质量的增加，固体分散体干燥的时间越短，干燥的效果越好（不同比例下RES收率分别为68.87%、71.11%、82.80%、88.23%、88.59%）。

2.6.3 筛网目数的考察 分别以RES原料药与P188的质量比为1 ∶1，在70 ℃下熔融，分别过18 目、40 目、80 目筛，制备RES-P188-SD，测定收率。结果显示，收率分别为75.80%、74.23%、73.01%。

2.7 正交试验设计

为获得较优的试验条件，根据预试验及单因素试验结果，以药物RES 与载体P188 质量比（A）、熔融温度（B）、筛孔目数（C）为考察因素，按L9（34）正交表进行试验，以RES-P188-SD的溶解度（x）和收率（y）为考察指标，以两者的综合评分（Z）进行结果分析，优选最优制备工艺。评分总分为100分，x、y分别为50分（Z＝xi/xmax×50+yi/ymax×50）。因素与水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

通过直观分析和方差分析可知A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C1＞C3＞C2，各因素对试验结果影响的大小顺序为C＞A＞B。由此可以得最优工艺条件为A3B2C1，即药物与载体质量比为1∶10、熔融温度为70 ℃、筛孔目数为80目。

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

2.8 验证试验

按最优工艺条件制备3 批RES-P188-SD样品。结果，3批RES-P188-SD 的溶解度分别为0.51、0.52、0.50 mg/ml，平均溶解度为0.51 mg/ml（RSD＝1.96%，n＝3）；收率分别为91%、90%、91%，平均收率为91%（RSD＝0.64%，n＝3）；15 min 累积溶出度分别为83%、84%、83%，平均累积溶出度为83%（RSD＝0.69%，n＝3），表明优化的处方和工艺合理、稳定。

2.9 扫描电镜分析物相表面特征

真空镀金70 s，用扫描电镜观察RES 原料药、载体材料P188、RES 与P188 的物理混合物以及RES-P188-SD 的表面和晶体结构。结果，RES 原料药与RES-P188-SD 的表面结构完全不同，RES 以大小不一的结晶体存在，P188 以非晶形存在；RES 与P188 的物理混合物为晶体和非晶体的混合物；而RES-P188-SD 中已经没有晶体存在，即表明RES 以非晶形态均匀分散在载体P188 中，形成了RES-P188-SD。电镜扫描图见图1。

2.10 抑菌试验[7]

2.10.1 菌悬液的制备 将各试验菌种（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌）活化后，用生理盐水制备菌悬液，并用麦氏比浊管比浊，制成浓度为108CFU/ml的菌悬液，备用。

2.10.2 药物分组 将“2.2”项下所制备的RES-P188-SD 用蒸馏水稀释至质量浓度为0.20 mg/ml，作为试验组；用蒸馏水制备RES原料药饱和水溶液，取上清液适量（相当于质量浓度为0.03 mg/ml），作为对照组。121 ℃高压灭菌20 min，置4 ℃冰箱中贮藏，备用。

图1 扫描电镜图A.RES原料药；B.P188；C.RES与P188物理混合物；D.RES-P188-SDFig 1 Scanning electron microscopy figuresA.crude resveratrol；B.poloxamer 188；C.physical mixture of resveratrol and poloxamer 188；D.resveratrol-poloxamer 188-solid dispersion

2.10.3 抑菌试验 采用管碟法将灭菌后的营养琼脂培养基加热融化，冷却至55 ℃左右，制备平板。取“2.10.1”项下制备的菌悬液0.3 ml，按“2.10.2”项下分组，用L型玻璃棒均匀涂在平板上，均匀放置3 个牛津杯，每个加入药物溶液0.2 ml，置37 ℃培养箱中培养18～24 h 后，测量抑菌圈直径。根据抑菌圈直径（mm）确定敏感性：抑菌圈直径小于10 mm 为耐药，10～15 mm 为中度敏感，15 mm 以上为高度敏感[8]。结果显示，RES饱和水溶液对金黄色葡萄球菌表现出耐药（抑菌圈直径为3 mm），对大肠埃希菌无抑制作用；RES-P188-SD 水溶液对金黄色葡萄球菌呈高度敏感（抑菌圈直径为17 mm），对大肠埃希菌呈中度敏感（抑菌圈直径为11 mm）。

3 讨论

本试验以P188 为载体，采用溶剂熔融法制备了RES-P188-SD。与RES原料药相比，RES-P188-SD溶解度提高了近17 倍（RES 原料药溶解度为0.03 mg/ml）。在pH 6.8 磷酸盐缓冲液中，RES 15 min累积溶出度仅为12%，物理混合物达39%，而RES-P188-SD 则达83%以上。可见，制成RES-P188-SD后显著提高了RES的溶解度和溶出速率。焦艳等[9]曾以聚乙烯吡咯烷酮为载体制备RES 固体分散体，其溶解度为0.23 mg/ml，人工胃液中2 h累积溶出度为88%。可见，P188和聚乙烯吡咯烷酮均对RES的溶解度和溶出度有所改善，但P188的改善作用更加明显。同时抑菌性试验结果表明，RES-P188-SD具有抑菌活性。

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