颈痹合剂的质量标准研究

魏晓舒，刘 燕，张敏娟（1.江苏省无锡药品检验所，江苏无锡 1408；.无锡市中医医院药剂科，江苏无锡 14071）

颈痹合剂是无锡市中医医院自制制剂，由羌活、葛根、木香等多味中药加工而成。该处方是成形的经验方，具有祛风除湿活血通络的功效，适用于风寒湿痹为主的颈型和神经根型颈椎病的治疗[1-2]。根据难治性疾病中药制剂的研发思路[3]，并且根据《医疗机构制剂配制监督管理办法（试行）》[4]和《医疗机构制剂注册管理办法》[5]要求，本着确保特色制剂质量、提升医院制剂标准的宗旨，笔者采用薄层色谱（TLC）法对紫花前胡苷、去氢木香内酯、葛根素进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对葛根的主要有效成分葛根素进行含量测定，并分析了制剂的相对密度、pH，为其质量控制提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器

1200 型HPLC 仪，包括紫外检测器（美国Agilent 公司）；AG-285 型电子天平、XP-6 型电子天平、MP220 型pH 计（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）。

1.2 药品与试剂

颈痹合剂（无锡市中医医院自制，批号：110302、110927、110928、120104、120105、120106，规格：500 ml/瓶）；葛根素对照品（批号：110752-200912，纯度：96%）、去氢木香内酯对照品（批号：111525-200505，纯度＞98%）；紫花前胡苷对照品（批号：111821-201102，纯度＞98%）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 羌活 取样品20 ml，加乙醚振摇提取2 次（每次20 ml），合并乙醚液备用；水液加水饱和正丁醇振摇提取2 次（每次20 ml），合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取紫花前胡苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1 ml含0.5 mg的对照品溶液。按处方及制备工艺制备缺羌活的阴性对照样品，按上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按上述TLC 法[2010 年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1A。

2.1.2 木香 取“2.1.1”项下乙醚液，低温挥去乙醚，残渣加三氯甲烷2 ml 使溶解，作为供试品溶液。取去氢木香内酯对照品适量，加三氯甲烷溶解制成每1 ml 含0.5 mg 的对照品溶液。按处方及制备工艺制备缺木香的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-甲苯-乙酸乙酯（2∶1∶1，V/V/V）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1B。

2.1.3 葛根 取样品30 ml，用氢氧化钠调pH 至9～10，加乙酸乙酯振摇提取2次（每次20 ml），弃去乙酸乙酯液；水液加稀盐酸调pH 至5～6，用乙酸乙酯振摇提取2 次（每次30 ml），合并提取液，经无水硫酸钠2 g滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。按处方及制备工艺制备缺葛根的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。取葛根素对照品适量，加甲醇制成每1 ml 含0.5 mg 的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰，详见图1C。

图1 薄层色谱图A.羌活[1、3、5.供试品（批号：120104、120105、120106）；2.阴性对照；4.对照品]；B.木香[1～3.供试品（批号：120104、120105、120106）；4.对照品；5.阴性对照]；C.葛根[1～3.供试品（批号：120104、120105、120106）；4.对照品；5.阴性对照]Fig 1 TLC chromatogramsA.Notopterygii Rhizoma et Radix[1.3.5.test samples（batch number：120104，120105，120106）；2.negative control；4.reference substance]；B.Aucklandia lappa[1-3.test samples（batch number：120104，120105，120106）；4.negative control；5.reference substance]；C.Pueraria lobata[1-3.test samples（batch number：120104，120105，120106）；4.negative control；5.reference substance]

2.2 相对密度和pH测定

按2010年版《中国药典》（一部）附录ⅧA 相对密度测定法比重瓶法测定样品的相对密度。结果显示，6批样品的相对密度平均值为1.08，RSD 为0.6%（n＝6）。按2010 年版《中国药典》（一部）附录ⅧG pH 测定法测定样品pH。结果显示，6 批样品pH平均值为4.5，RSD为1.5%（n＝6）。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：XTer-ra®RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：250 nm；柱温：25 ℃；进样量：10µl。当信噪比为12∶1、3.9∶1时，葛根素定量限、检测限分别为0.33、0.17 μg/ml。在上述色谱条件下，理论板数以葛根素峰计应不低于5 000，分离度应不小于1.5，详见图2。

2.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取葛根素对照品1.257、1.732 mg，用30%乙醇分别制成每1 ml 含葛根素0.120 7、0.166 3 mg 的对照品贮备液Ⅷ、Ⅷ。精密吸取对照品贮备液Ⅷ适量，用30%乙醇制成每1 ml 含葛根素6.034 μg 的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密吸取样品5 ml，置于100 ml量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀，静置1 h，取上清液，滤过；精密吸取续滤液1 ml，置于10 ml 量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图2 高效液相色谱图A.阴性对照；B.对照品；C.供试品；1.葛根素Fig 2 HPLC chromatogramsA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.puerarin

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取不含葛根的其他药味各适量，按颈痹合剂的制备工艺制成缺葛根的阴性样品，再按“2.3.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3.5 线性关系考察 分别精密量取“2.3.2”项下葛根素对照品贮备液Ⅷ适量，用30%乙醇制成质量浓度分别为33.26、16.63、8.315、4.158、2.079 μg/ml的系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液各10 μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样6次测定，记录峰面积。以葛根素质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝44.048x－14.042（r＝0.999 8，n＝6）。结果表明，葛根素检测质量浓度线性范围为2.079～33.26 μg/ml。

2.3.6 精密度试验 取“2.3.2”项下对照品溶液适量，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD为0.14%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品（批号：110302）溶液适量，分别于放置0、3、6、9、12 h 时进样测定，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD 为0.2%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.8 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：110302）适量，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，葛根素峰面积的RSD为0.2%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已含量的样品（批号：110302）适量，共6份，分别加入一定量葛根素对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.3.10 样品含量测定 取6 批样品各适量，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

颈痹合剂属多组分制剂，其中主药羌活中紫花前胡苷、木香中去氢木香内酯和葛根中葛根素均具有鉴别的特征性意义，而处方中其他药材均不含这些特征成分[6]，因此选择该三种成分进行TLC 鉴别。经过对供试品溶液前处理、展开剂的选择及显色方式筛选，该色谱结果专属性较强、斑点清晰、阴性对照无干扰，这对原药材的质量及制备工艺都起到了监督作用。

有研究报道，HPLC测定颈痹颗粒中葛根素含量时流动相采用甲醇-水（25∶75，V/V）[7]。本研究的预试验结果表明，针对以水为溶剂的供试品溶液，应采用乙腈-水配比的流动相，用适量磷酸调节可使葛根素峰形对称，清除杂峰能力增强，重现性较好。当水比例占很大部分时，不宜采用一般的ODS色谱柱，而利用屏蔽技术的XTerra®RP色谱柱有很好的水浸润性，即便是使用100%的水溶液作为流动相，亦可获得稳定的色谱结果。2010 年版《中国药典》（一部）规定：葛根药材按干燥品计算，葛根素含量不得少于2.4%[8]，这为制定颈痹合剂中葛根素定量指标提供了参考依据，也给制备工艺提出了新要求。

综上所述，该方法操作简便、重复性好，可用于颈痹合剂的质量控制。

[1]张兴国，周文浩.颈痹合剂治疗颈型及神经根型颈椎病80 例临床观察[J].长春中医药大学学报，2011，27（2）：263.

[2]吴震海.颈痹合剂治疗颈型及神经根型颈椎病的疗效观察[J].临床合理用药，2012，5（3A）：79.

[3]宋洪涛，张晶，周欣，等.当前医院制剂发展策略与研发思路探讨[J].中国药房，2009，20（13）：999.

[4]国家食品药品监督管理局.医疗机构制剂配制监督管理办法：试行[S].2005-06-01.

[5]国家食品药品监督管理局.医疗机构制剂注册管理办法：试行[S].2005-08-01.

[6]肖培根.新编中药志：第一卷[M].北京：化学工业出版社，2002：121.

[7]何建华，钱永昌，许勇.HPLC 测定痉痹颗粒中葛根素的含量[J].海峡药学，2005，17（6）：81.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：313.