芪七连胶囊的质量标准研究Δ

罗 远，叶 雲，岳桂华，梁健钦，4（1.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 50011；.解放军第0医院，南宁 5001；.广西中医药大学科技处，南宁 50001；4.广西中医药大学中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 50001）

芪七连胶囊是广西中医药大学附属瑞康医院开发的院内制剂（原临床方剂为益气活血方），由黄芪、黄连、黄柏、三七等7味中药组成，具有益气活血、清热解毒的功效[1-2]，适用于由高血压引起的眩晕、头痛、胸闷、心悸、烦躁等症的治疗[3-4]。其原质量标准仅有黄芪和三七的定性鉴别[5]。为了对其进行深入的开发，本研究参照《药品注册管理办法》六类新药的有关要求，建立了芪七连胶囊中黄芪、黄柏、黄连的薄层色谱（TLC）鉴别方法和人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，为制定芪七连胶囊的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括二级管阵列检测器（美国Agilent公司）；B3200S-T 型超声波清洗仪（上海必能信超声有限公司）；AG285型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；ZF-20C型自动紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）。

1.2 药品与试剂

芪七连胶囊（广西中医药大学附属瑞康医院民族医药研发基地，批号：2013062101、2013062102、2013062103，规格：0.3 g/粒）；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201314，纯度＞98%）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度＞98%）、人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201128，纯度＞98%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201223，纯度＞98%）、三七皂苷R1对照品（批号：110745-201318，纯度＞98%）、黄芪对照药材（批号：120974-201311）、黄柏对照药材（批号：121510-201105）、黄连对照药材（批号：120913-201310）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 黄芪 取本品内容物2 g，研细，加甲醇50 ml，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml 使溶解，用水饱和正丁醇提取2 次（每次20 ml）；合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液洗涤2 次（每次20 ml）；再以正丁醇饱和的水洗至中性，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，即得供试品溶液。取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的对照品溶液。另取黄芪对照药材2 g按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方及制备工艺制备缺黄芪的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法（2010版《中国药典》（一部）附录ⅥB）试验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-丙酮-水（13∶5∶7∶2∶1，V/V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，详见图1A。

图1 薄层色谱图A.黄芪[1～3.供试品（批号：2013062101、2013062102、2013062103）；4.对照药材；5.阴性对照；6.对照品]；B.黄柏、黄连[1～3.供试品（批号：2013062101、2013062102、2013062103）；4.黄柏对照药材；5.黄连对照药材；6.缺黄柏的阴性对照；7.缺黄连的阴性对照；8.对照品）]Fig 1 TLC chromatogramsA.Astragali Radix[1-3.test samples（batch number：2013062101，2013062102，2013062103）；4.reference crud herb；5.negative control；6.reference substance）]；B.Phellodendri chinensis and Coptidis rhizom[1-3.test samples（batch number：2013062101，2013062102，201306 2103）；4.reference crube herb of Phellodendri Chinensis Cortex；5.reference crube herb of Coptidis Rhizoma；6.negative control without P.chinensis；7.negative control without C.rhizom；8.reference substance）]

2.1.2 黄柏、黄连 取本品内容物1 g，研细，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，即得供试品溶液。取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的对照品溶液。另分别取黄柏、黄连对照药材各0.5 g，按供试品溶液制备方法分别制成对照药材溶液。再分别制备缺黄柏、黄连的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制成阴性对照溶液。按TLC 法（2010 版《中国药典》（一部）附录ⅥB）试验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶4.5∶1.5∶0.5，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰，详见图1B。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，20%→42%A；30～36 min，20%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：20 ℃。在上述色谱条件下，理论板数均大于6 000，分离度均大于1.7，各成分基线分离良好，详见图2。

图2 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.人参皂苷Rg1；2.人参皂苷Rb1；3.三七皂苷R1Fig 2 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.ginsenosides Rg1；2.ginsenosides Rb1；3.notoginsenosides R1

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml 含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1分别为0.45、0.45、0.15 mg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 ml，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用水饱和的正丁醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 m1，置于分液漏斗中，加氨试液洗涤2 次（15、10 ml），取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 ml 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方及制备工艺制备缺三七的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μl）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1回归方程 分 别 为y＝308.915 885x+4.461 478 6（r＝0.999 8）、y＝152.225 275x+38.671 429（r＝0.999 6）、y＝211.146 52x+7.014 285 7（r＝0.999 5，n＝6）。结果表明，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1检测进样量线性范围分别为0.9～9.0、0.94～9.4、0.3～3.0 μg。

2.2.6 精密度试验 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面积的RSD分别为2.83%、1.20%、0.89%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（批号：2013062101）适量，分别于放置0、1、2、3、5、12、24、48 h时进样测定，记录峰面积。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面积的RSD分别为1.78%、0.70%、1.46%（n＝8），表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.2.8 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：2013062101）适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1峰面积的RSD分别为1.12%、0.60%、1.15%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取样品（批号：2013062101）适量，共6 份，分别加一定质量的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.10 样品含量测定 取3 批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，结果见表2。

3 讨论

芪七连胶囊中的黄连、黄柏共同含有小檗碱、药根碱等成分[6-7]，以常用的TLC 法鉴别可见，阴性对照品在紫外光灯（365 nm）下有相同的斑点，且两味药相互干扰。笔者参照2010 版《中国药典》（一部）收载的青娥丸项下黄连和黄柏的TLC 法[8]，同时使用黄柏、黄连对照药材以及盐酸小檗碱作对照，可以进行有效鉴别。

芪七连胶囊中三七作为臣药，具有活血止血、祛瘀生新、消肿定痛之功效，在本方剂中是益气活血的主要成分[9-10]。因此，笔者采用HPLC测定制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1三七皂苷R1作为质量控制指标。在供试品的制备中，笔者曾比较了以甲醇和水饱和的正丁醇作为提取液制备供试品。结果，以甲醇作提取液时干扰较大，而以水饱和的正丁醇超声提取，最后以氨试液洗涤，能有效地去除干扰。

综上所述，该方法操作简便、重复性好，可用于芪七连胶囊的质量控制。

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