黑顺片与大黄联用对次乌头碱在大鼠体内药动学的影响

干小红，任常谕（成都市第五人民医院药剂科，成都 611130）

附子是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根加工品，味辛、甘，性热，有毒[1]。因为其生品有大毒，所以临床上多用其炮制品。黑顺片为附子的加工炮制品，其中毒性成分乌头碱、中乌头碱的含量很低，主要的毒性成分为次乌头碱。附子配伍大黄为常用药对，源于张仲景的《金匮要略》中的“大黄附子汤”，方中以大黄苦寒攻下，附子辛热散寒，寒热并用，相反相成，主治寒积便秘。现代化学和药理学研究表明，附子配伍大黄具有增效减毒的作用，但从药动学角度研究其配伍机制的报道甚少。为了探索其配伍机制，更好地了解附子配伍大黄中成分发挥药理作用的过程和机制，相应的药动学研究显得非常必要。笔者选取临床上常用的附子的炮制品黑顺片与大黄联用，采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）法，以盐酸巴马汀为内标，研究其对次乌头碱在大鼠体内药动学的影响。

1 材料

1.1 仪器

WatersZQ2000-LC-MS 分析仪（美国Waters 公司）；1424-1型台式高速离心机、0412-1型台式低速离心机（上海医疗器械有限公司手术器械厂）。

1.2 药材、药品与试剂

黑顺片为毛茛科多年生草本植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根的炮制加工品，大黄为唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.exBalf.的根及根茎，经笔者鉴定均为真品，购于四川省中药材饮片公司；次乌头碱对照品（上海东方药品科技实业有限公司，批号：110798-200404，含量测定用）；盐酸巴马汀对照品（内标物，中国食品药品检定研究院，批号：110732-200506，含量测定用）；甲醇、甲酸均为色谱纯，乙酸乙酯、氨水均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

1.3 动物

SD大鼠，SPF级，♂，体质量为230～250 g，购于四川省人民医院实验动物研究，许可证号：SCXK（川）2008-24。

2 方法与结果

2.1 药液的制备

称取黑顺片100 g，用10 倍量水浸泡30 min，煮沸后微沸45 min，称取大黄75 g浸泡30 min后，于黑顺片煮沸45 min前15 min 下大黄，共同煎煮15 min，过滤，滤液浓缩至100 ml，得含黑顺片1 g（生药）/ml的黑顺片-大黄合煎液。除不加入大黄外，其余按上述煎煮方法煎煮浓缩至100 ml，得1 g（生药）/ml的黑顺片单煎液。

2.2 给药与取血方案

取大鼠，适应性喂养1 周后，随机分为单用（黑顺片单煎液）组和联用（黑顺片-大黄合煎液）组，每组18 只，ig 相应药物，给药剂量均以按黑顺片计为10 g（生药）/kg。分别于给药前（0 h）和给药后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h经颈动脉插管处采血约0.3 ml，每个时间点取6只，置于预先肝素化的1.5 ml离心管中，以离心半径6.5 cm（下同）、4 000 r/min离心5 min，取上层血浆样品，于－20 ℃保存。

2.3 血浆样品的处理

取血浆样品160 μl，加入20 μl 内标盐酸巴马汀溶液（800 ng/ml），混匀，加入16 μl氨水碱化后，混匀；加入5倍量的乙酸乙酯涡旋8 min，于4 ℃下4 000 r/min 离心5 min，取上清液在38 ℃水浴条件下氮气流吹干；残渣用80 μl 50%甲醇溶解，进样测定。

2.4 检测条件

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini C18110A（100 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）（含0.1%甲酸）（28∶72，V/V）；流速：0.2 ml/min；进样量：5 μl；柱温：30 ℃。

2.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离（ESI），正离子模式（ESI+）选择性离子监测（SIR）检测。毛细管电压：2.5 kV；锥孔电压：45 V；二级锥孔电压：1 V；六级杆透镜电压：0.5 V；ESI源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：300 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h；锥孔气流量：50 L/h。SIR 检测：次乌头碱m/z616.02，巴马汀m/z352.31。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 分别取空白血浆、空白血浆+次乌头碱、两组大鼠ig 药物后3 h 的血浆样品，除空白血浆不加内标外其余均按“2.3”项下方法处理，进样测定，记录色谱。结果表明，大鼠血浆中的内源性物质对测定无干扰，次乌头碱和巴马汀的保留时间分别为20.45、7.49 min，二者分离度良好，响应值高。

2.5.2 线性关系考察 取1 μg/ml 的次乌头碱对照品溶液，用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为0.819 2、1.638 4、4.096、10.24、25.6、64、160、400、800 ng/ml 的系列次乌头碱标准溶液。取160 μl空白血浆，分别加入上述系列标准溶液20 μl，混匀后，按照“2.3”项下方法处理后，使次乌头碱的终质量浓度分别为0.102 4、0.204 8、0.512、1.28、3.2、8、20、50、100 ng/ml，进样测定，记录峰面积。以次乌头碱的质量浓度（x）为横坐标、次乌头碱与内标峰面积之比（y）为纵坐标进行加权（1/c2）最小二乘法计算，进行回归分析。得回归方程为y＝0.100 1x+0.086 1（r＝0.998 7），表明次乌头碱检测质量浓度的线性范围为0.102 4～100 ng/ml；定量限为0.1 ng/ml（信噪比为10）。

2.5.3 基质效应与提取回收率试验 取空白血浆160 μl，共15份，按“2.5.2”项下方法制成次乌头碱质量浓度分别为0.2、3.2、85 ng/ml的血浆样品，照“2.3”项下方法处理，每个浓度平行制备5份，进样测定，得次乌头碱与内标的峰面积比y1；取空白血浆160 μl，共15 份，按“2.3”项下方法处理后，加入次乌头碱对照品溶液和内标溶液制备成含次乌头碱质量浓度分别为0.2、3.2、85 ng/ml 的溶液，每个浓度平行制备5 份，进样测定，得次乌头碱与内标的峰面积比y2；取次乌头碱质量浓度分别为0.2、3.2、85 ng/ml的对照品溶液，每个浓度平行5份，共15份，加入20 μl 内标溶液，进样测定，得次乌头碱与内标的峰面积比y3。以y1/y2计算提取回收率，以y2/y3计算基质效应。结果显示，提取回收率和基质效应均在85.0%～106.0%之间，均符合生物样品分析方法要求。

2.5.4 精密度试验 分别取空白血浆160 μl，按“2.5.2”项下方法制成次乌头碱质量浓度分别为0.2、3.2、85 ng/ml 的血浆样品，照“2.3”项下方法处理，每个浓度平行制备5份，进样测定，连续测定3 d。结果，日内RSD 为6.45%（n＝5），日间RSD 为8.36%（n＝3）。

2.5.5 稳定性考察 分别取空白血浆160 μl，按“2.5.2”项下方法制成次乌头碱质量浓度分别为0.2、3.2、85 ng/ml 的血浆样品，照“2.3”项下方法处理，每个浓度平行制备5 份，分别于室温放置8 h、－20 ℃冻存1 d、反复冻融3次，考察稳定性。结果显示，上述条件下次乌头碱的RSD 均小于5.25%（n＝5）。

2.6 药动学参数计算

取“2.2”项下各时间点的血浆样品，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积，绘制药-时曲线。利用DAS2.0.1药动学软件计算药动学参数。两组大鼠体内次乌头碱的药-时曲线见图1，药动学参数见表1。

图1 两组大鼠体内次乌头碱的药-时曲线Fig 1 Blood concentration-time curves of hypaconitine in rats of 2 groups

表1 两组大鼠体内次乌头碱的药动学参数（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of hypaconitine in rats of 2 groups（，n＝6）

表1 两组大鼠体内次乌头碱的药动学参数（，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of hypaconitine in rats of 2 groups（，n＝6）

注：与单用组比较，＊P＜0.05Note：vs.single drug group，＊P＜0.05

本实验按黑顺片生药量的等剂量给药，其中次乌头碱在黑顺片单煎液、黑顺片-大黄合煎液中的含量分别为126、72.4µg/kg，用AUC与对应的次乌头碱给药剂量的比值表示大鼠体内次乌头碱的吸收程度，由此可得黑顺片单煎液、黑顺片-大黄合煎液中次乌头碱在大鼠体内的吸收程度分别为0.207、0.090 g/（ml·h）。

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。与单用组比较，联用组大鼠体内次乌头碱的t1/2、AUC0-10h、cmax均减小（P＜0.05），吸收程度呈下降趋势，说明大黄可以抑制次乌头碱在大鼠体内的吸收，加快其在体内的消除。

3 讨论

药-时曲线显示，次乌头碱在60 min内达到浓度最高峰，达峰后又迅速降低，曲线逐渐缓和。这表明乌头类生物碱在大鼠体内吸收较为迅速，而且代谢速度较快。

本研究结果显示，与给予黑顺片水煎液相比，给予黑顺片-大黄合煎液后大鼠体内次乌头碱的AUC0-10h和cmax均降低（P＜0.05），且其吸收程度下降。虽然有报道中药之间配伍有吸收增强的结果[2-3]，但也有研究报道通过配伍后药物中的有效成分减少[4-5]，尤其是有毒的中药，这与本研究结果一致。

目前，大多都是用药效学或化学的角度研究黑顺片配伍大黄减毒的机制[6-7]，然而从药动学角度研究有毒中药配伍机制的较少。本实验从药动学的角度研究了其减毒的机制发现，大黄会抑制次乌头碱在大鼠体内的吸收，加快其在体内的消除，其具体机制还需进一步深入研究。

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