固定化2,4,6-三氯酚降解菌修复土壤污染效果及影响因子实验研究

汪银梅，张连叶，彭 凯

(1.徐州工程学院 环境工程学院，江苏 徐州 221111; 2.河南正达建筑工程有限公司，河南 新乡 453000； 3.河南省南阳市镇平县污水处理中心，河南 南阳 473000)



固定化2,4,6-三氯酚降解菌修复土壤污染效果及影响因子实验研究

汪银梅1，张连叶2，彭 凯3

(1.徐州工程学院 环境工程学院，江苏 徐州 221111; 2.河南正达建筑工程有限公司，河南 新乡 453000； 3.河南省南阳市镇平县污水处理中心，河南 南阳 473000)

从2，4，6-三氯酚长期驯化的土壤中分离出一株以2，4，6-三氯酚为唯一碳源的菌种，通过包埋固定化技术将其固定，然后用于修复被2，4，6-三氯酚污染的土壤，考察了固定化与否、环境温度和土壤湿度以及底物浓度等条件对2，4，6-三氯酚修复效果。结果表明：固定化细胞系统去除2，4，6-三氯酚达到85%，明显优于非固定化细菌系统，25℃条件下，2，4，6-三氯酚修复效果最好，16 d对2，4，6-三氯酚的去除率达到94%，湿度为70%时效果最佳，最佳条件下2，4，6-三氯酚去除率达到了95.5%，而且底物浓度(2，4，6-三氯酚)在100～300 mg/kg对固定化细胞系统无明显影响。

固定化细胞；2，4，6-三氯酚；土壤污染；生态修复；生物降解

2,4,6-三氯酚是重要的化工原料，可用作杀菌剂、防腐剂、脱叶剂，在有机合成、造纸、印染行业广泛使用。由于具有高毒性和难降解性，其被美国国家环保局(USEPA)列入优先控制污染物黑名单[1]。2,4,6-三氯酚主要通过农药施放、污水灌溉进入土壤[2]。其对人类、水生动植物及微生物会产生很大影响，对人类有很强的致畸、致癌和致突变作用[3]。因此，受氯代酚污染的土壤治理日益引起人们的关注，而且受氯代酚污染的土壤生产农作物时，会引起农作物减产、营养成分缺失等[4-5]。

由于氯代酚类物质具有很强的毒性，微生物以氯酚为基质细胞的产率系数很低，难以保持和扩增生物量, 所以对于被2,4,6-三氯酚污染的土壤仅利用土著微生物进行降解非常困难。对于2,4,6-三氯酚的降解，常采用投加具有高效降解此类有机物的菌种以强化和补充土著微生物数量不足的问题。但如果将具有高效降解2,4,6-三氯酚能力的菌种投加到受2,4,6-三氯酚污染的土壤中会因为外界环境因素，如湿度、光照、吞噬和灭活等作用使具有降解2,4,6-三氯酚能力的菌种发挥不到降解作用。固定化细胞技术是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性可以反复使用的一种技术，其可提高微生物的催化活性和污染物降解速率[6-8]。

将生物堆肥技术和污染物降解固定化技术结合作为一种新型的微生物修复技术，固定化微生物修复有机污染土壤受到越来越多关注，国内外相关研究刚刚开始[9]。从土壤中筛选出高效降解2,4,6-三氯酚功能菌，并利用常规固定化技术对其进行固定。通过研究高效降解2,4,6-三氯酚的功能菌降解能力及其影响因子，为氯代酚类物质污染的土壤和水体修复提供参考。

1 实验材料和方法

1.1 菌种来源及实验对象

菌种培养和驯化：取徐州工程学院中心校区周边农田土壤，以2,4,6-三氯酚为唯一碳源进行4个月的培养和驯化。每周轻轻翻动一次，并补充一定量的水分以保持土壤的湿度。

培养基：(NH4)2SO4为0.2 g/L,KH2PO4为0.6 g/L,Na2HPO4为0.7 g/L,MgSO4.7H2O为0.5 g/L,酵母膏为0.02 g/L,2,4,6-三氯酚为8～104 mg/L，调节pH 7.2～ 7.6，灭菌备用。

2,4,6-三氯酚母液：将0.5 g的2,4,6-三氯酚晶体加入到250 mL蒸馏水中和10 mL的乙醇溶液中，最后将定容至1 L，备用。

1.2 菌种的分离和固定化

菌种的分离：将含有以2,4,6-三氯酚为唯一碳源的菌种土壤1 g转移到10 mL无菌试管中，加入9 mL的无菌水，放入200 r/min的摇床中10 min，静置半分钟后取上清液1 mL加入配置好的培养基中，37 ℃条件下培养7 d。

菌种的扩大培养：将培养基中菌落在无菌条件下用接种环调取至50 mL的液体培养基中，将盛有液体培养基和目的菌种的锥形瓶密封在摇床中培养。摇速为100 r/min，温度为25 ℃，连续培养10 d后，将液体培养基和菌种转移至100 mL的锥形瓶中，加入50 mL的液体培养基，培养条件保持不变。连续培养10 d后，将液体培养基和菌种转移至200 mL的锥形瓶中，并加入100 mL的液体培养基，再培养10 d后保持，备用。

1.3 目的菌株固定化

取少量菌液，手动摇动使菌株不集中在一起，加入2.5%的海藻酸钠溶液(V目的菌液∶V海藻酸钠溶液=1∶3)，充分混匀后，用注射针头吸取混合液滴入一定质量分数(4%)的CaCl2溶液中，形成透明小球，直径约2～3 mm，放入4 ℃冰箱静置2 h，再放入25 ℃恒温箱2 h固定完全后用滤斗过滤。取出后用甘露醇溶液冲洗两次后保存于灭菌袋中，备用。

1.4 试验方法

实验土样研碎过80目筛子后，将土样分成若干组，每组100 g。将固定化菌株10粒加入模拟土样中，使土样埋没固定化菌株，放入生化培养箱中培养，每天喷洒未加2,4,6-三氯酚液体培养基5 mL于模拟土样中。主要实验目的有：(1)考察固定化和非固定化两个系统对2,4,6-三氯酚修复效果的差异；(2)研究固定化细胞系统在温度(20 ℃、25 ℃和30 ℃)和含水率(50%、60%和70%)等因子差异条件下对2,4,6-三氯酚修复效果；(3)考察固定化系统对不同浓度的2,4,6-三氯酚对固定化修复系统性能的影响。

取模拟土样1 g，分两次加入10 mL蒸馏水，每次超声波萃取20 min，3 500 r/min离心5 min，将两次上清液合并，上清液中的2,4,6-三氯酚采用液相色谱分析(HP 1050)。色谱柱为250 mm×416 mm ZORBAX SB -C18反向柱，流动相组成为甲醇：2%冰乙酸水溶液=76∶24 (V/V) ，流速为1.5 mL/ min，检测波长为275 nm，并将土样中的2,4,6-三氯酚浓度换算成模拟土样中残留的浓度。

2 实验结果与讨论

2.1 固定化细胞和游离态细胞系统对2,4,6-三氯酚修复效果

25 ℃和湿度为60%条件下，固定化细胞对2,4,6-三氯酚修复效果如图1所示。

从图1可以看出：起始2,4,6-三氯酚的浓度为200 mg/kg(土样)，16 d后，固定化细胞系统(去除率90.5%)比游离态细胞系统(去除率47.5%)对2,4,6-三氯酚修复效果要高很多，说明游离态细胞在开始6 d对2,4,6-三氯酚有相当快的修复效果，2,4,6-三氯酚浓度下降了40%(80 mg/kg)，而第7～16天2,4,6-三氯酚的浓度仅下降了15 mg/kg(土样)；而固定化细胞系统前6 d，2,4,6-三氯酚的浓度下降了76%。在第7～16天2,4,6-三氯酚的浓度也下降了29 mg/kg(土样)。分析原因有：(1)在实验初期，2,4,6-三氯酚均能发挥作用，使2,4,6-三氯酚大量降解，并呈现出先快后慢的趋势；(2)固定化细胞比游离态细胞具有良好的耐失活性，耐2,4,6-三氯酚毒性强。

图1 2,4,6-三氯酚降解菌株固定化与否对2,4,6-三氯酚修复效果

2.2 温度对固定化细胞2,4,6-三氯酚降解菌系统修复效果的影响

20 ℃、25 ℃和30 ℃条件下，湿度为60%时，固定化细胞对2,4,6-三氯酚修复效果如图2所示。

图2 不同温度下，固定化细胞系统对2,4,6-三氯酚修复效果

20 ℃、25 ℃和30 ℃条件下，固定化细胞技术降解2,4,6-三氯酚污染是可行高效的。经过16 d的修复，在20 ℃、25 ℃和30 ℃温度下，固定化细胞系统均能将2,4,6-三氯酚的质量浓度从200 mg/g(土样)下降30 mg/g(土样)以上，去除率保持在85%以上。说明在20 ℃以上时，固定化细胞内的目的菌株均能保持较高的生物活性。25 ℃条件下，2,4,6-三氯酚修复效果略好些，16 d后2,4,6-三氯酚的去除率达到94%。

2.3 含水率对固定化细胞2,4,6-三氯酚修复效果影响

湿度50%、60%和70%条件下，固定化细胞系统降解2,4,6-三氯酚污染是可行高效的。经过16 d的修复，湿度50%，60%和70%条件下，固定化细胞系统均能将2,4,6-三氯酚的质量浓度从200 mg/kg(土样)下降27 mg/kg(土样)以上，去除率保持在86.5%以上。说明在湿度50%，固定化细胞内的目的菌株均能保持较高的生物活性。湿度70%条件下，2,4,6-三氯酚修复效果略好些，16 d后2,4,6-三氯酚的去除率达到95.5%。

图3 不同湿度下固定化细胞系统对2,4,6-三氯酚修复效果

2.4 底物浓度对固定化细胞降解性能的影响

在25 ℃、pH为7、湿度75%条件下，改变反应体系中2,4,6-三氯酚的浓度，考察固定化细胞对不同2,4,6-三氯酚浓度的降解情况，结果如图4所示。

图4 不同湿度下固定化细胞系统对2,4,6-三氯酚修复效果

由图4可知：当2,4,6-三氯酚浓度在100～300 mg/kg波动时，固定化细胞系统对2,4,6-三氯酚的降解并没有表现出显著差异，最终2,4,6-三氯酚的浓度在16 d后均下降至9 mg/kg、12 mg/kg和14 mg/kg，其去除率分别达到了91%、94%和95.3%。与李军红的研究成果有类似之处[10]。可能是因为固定化细胞在一个相对稳定的环境，当外界的环境有较大变换时，而不会较大地影响到其内部微生物的生理生化性能，使处理效果保持在较为稳定的水平。

3 结论

采用固定化技术修复污染土壤是一种新型的土壤修复技术，其可以克服非固定化细胞耐环境因素不利的效果。将目的菌种进行固定并修复2,4,6-三氯酚污染土壤时效果(85%)明显优于非固定化细菌(47.5%)。温度在25 ℃时，2,4,6-三氯酚修复效果最好，16 d后2,4,6-三氯酚的去除率达到94%；土壤湿度为70%时效果最佳，16 d后对2,4,6-三氯酚去除率达到了95.5%。底物浓度(2,4,6-三氯酚)在100～300 mg/kg波动时，固定化细胞系统对底物的修复效果无明显差异。

[1]纪靓靓,李法云,罗义,等.2,4,6-三氯苯酚诱导鲫鱼肝脏自由基的产生及其氧化应激[J]. 应用生态学报,2007,18(1):129-132

[2]刘训才,沈敏,李胜清,等.咪鲜胺及其代谢产物2,4,6-三氯苯酚在蘑菇及土壤中的残留动态[J].农药学学报,2009,11(3):362-366

[3]Hu G J, Chen S L, Zhao Y G, et al.Persistent toxic substances in agricultural soils of Lishui County, Jiangsu Province, China[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2009,82(1):48-54．

[4]杜青平,贾晓珊.1,2,4-三氯苯对大蒜根尖分生细胞有丝分裂的影响[J].环境科学学报,2006,6(6):962-967.

[5]骆永明.污染土壤修复技术研究现状与趋势[J].化学进展，2009，21(2/3):558-565.

[6]Wang T C, Lu N, Li J, et al. Plasma-TiO2catalytic method for high Efficiency remediation of p-nitrophenol contaminated soil in pulsed discharge[J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(21):9301-9307.

[7]Zhang Yongming, Sun Xia,Chen Lujun, et al. Integrated photocatalytic-biological reactor for accelerated 2,4,6-trichlorophenol degradation and mineralization[J]. Biodegradation,2002,17:1234-1243.

[8]Leigh M B, Fletcher J S, Fu X O, et al. An important source of microbial substrates in rhizosphere remediation of recalcitrant contaminants[J]．Environmental Science & Technology,2002,36(7):1579-1583.

[9]钱林波,元妙新,陈宝梁.固定化微生物技术修复 PAHs 污染土壤的研究进展[J].环境科学,2012,33(5):1767-1776.

[10]李军红,颜慧,宋文华.氯磺隆降解优势菌的筛选固定化及特性研究[J].农业环境科学学报,2004,23(5):985-988.

[11]颜家保, 王巧凤,魏鑫,等.Elizabethkingia sp. DBP-WUST对邻苯二甲酸二丁酯的降解特性研究[J].徐州工程学院学报：自然科学版,2012,27(3):16-21.

Characteristics and influence factors of polluted soil bioremediation by using 2,4,6- Dichlorophenol-degrading immobilized

WANG Yin-mei1， ZHANG Lian-ye2， PENG Kai3

(1.SchoolofEnvironmentalEngineeringofXuzhouInstituteofTechnology，Xuzhou221111，China；2.HenanZhengdaConstructionCo.,Ltd.,Xinxiang453000,China;3.ZhenpingSewageTreatmentCenterofNanyang,HenanProvince,Nanyang473000,China)

A 2,4,6-Dichlorophenol-degrading pure culture was obtained for polluted soil and immobilized by cast investment, and investigated to degrade 2,4,6-Dichlorophenol efficiency. The results showed that the degrade 2,4,6-Dichlorophenol efficiency of the aimed bacteria immobilization system is 85% and higher than that of non-immobilization system(47.5%), 2,4,6-Dichlorophenol removal efficiency is higher (94%) after 16 d under temperature of 25℃, relative to 20℃ and 30℃. And 2,4,6-Dichlorophenol removal efficiency is more (95.5%) after 16 d under humidity of 70%, relative to 50% and 60%. When the concentration of 2,4,6- Dichlorophenol ranged from 100mg/kg to 300mg/kg, the removal rate of 2,4,6-Dichlorophenol has no significant difference. The immobilized cells technology is a good bioremediation method for polluted soil, the bioremediation efficiency is high and stable for polluted soil in the immobilized cells system.

immobilized cell; 2,4,6-Dichlorophenol; polluted soil; eco-remediation; biodegradation

2015-07-21

徐州工程学院校级科研项目(XKY2013407)

汪银梅(1980-)，女，江西都昌人，硕士，讲师。

1674-7046(2015)06-0061-05

10.14140/j.cnki.hncjxb.2015.06.013

X53

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