声动力治疗对荷瘤鼠肿瘤微环境巨噬细胞的影响

王晓龙，王姗，郑金华，郭福林



声动力治疗对荷瘤鼠肿瘤微环境巨噬细胞的影响

王晓龙，王姗，郑金华，郭福林

目的 检测声动力治疗前后荷瘤鼠肿瘤微环境中巨噬细胞数量以及细胞因子的变化。方法 选取12只BALB/C小鼠制备荷瘤模型，随机分为2组，对照组6只，未予任何处理；SDT组6只，给予小鼠腹腔注射5-ALA(250mg/kg)，并进行超声照射，超声强度为2.0W/cm2；2周后停止治疗，检测肿瘤生长情况及荷瘤鼠体质量变化情况，并采用免疫组化染色检测CD68及细胞因子IFN-γ和IL-10水平变化。结果 治疗期结束2周时，对照组小鼠肿瘤体积为(810±78)mm3，SDT组为(432±58)mm3，SDT组肿瘤体积抑制率为46.67%。对照组小鼠体质量为(24.00±0.58)g,SDT组小鼠为(24.20±0.61)g，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，SDT组CD68表达水平提高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表达下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表达增高(t=-5.034，P=0.008)。结论 声动力治疗可影响肿瘤微环境中巨噬细胞数量和细胞因子的变化。

声动力治疗；肿瘤微环境；巨噬细胞；BALB/C小鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.03.019

声动力治疗基于超声联合声敏剂的协同作用[1，2]，于1990年由Umemura等[3]首次提出。超声波具有相对较低的组织衰减系数，具有非侵入性穿透深部生物组织的能力。此外，超声波的能量可以聚焦在恶性肿瘤部位，从而局部激活优先累积在肿瘤组织中的声敏剂，造成对靶细胞的损伤，而对周围健康组织的损害最小。目前，声动力治疗的研究主要集中在对肿瘤细胞的直接杀伤作用[4～8]，引起肿瘤细胞凋亡[9～13]、自噬[14，15]和坏死等。但是声动力治疗对肿瘤微环境，尤其是肿瘤微环境免疫状态的影响仍然不明确。肿瘤微环境中的巨噬细胞属于固有免疫相关重要的免疫细胞，在免疫激活的过程中，肿瘤微环境的巨噬细胞最先被激活，成为抗肿瘤免疫的重要桥梁。现通过检测CD68、IFN-γ 与IL-10表达的变化探讨声动力治疗对移植肿瘤微环境巨噬细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)试剂：声敏剂5-氨基酮戊酸(5-amino-levulinic acid,5-ALA)购自西格玛奥德里奇公司；多克隆兔抗CD68、IFN-γ和IL-10试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。(2)肿瘤细胞：人舌鳞癌细胞SAS细胞(Health Science Research Resources Bank，大阪，日本)，培养于含10%胎牛血清的1640培养液中,放置于37℃、5%CO2湿度孵箱内。(3)器械：超声治疗仪由哈尔滨工业大学自主制造。参数分别为1.1 MHz、2.0 W/cm2、10 %占空比。天平购买于长沙市秋龙仪器设备有限公司。(4)动物：雄性BALB/C无胸腺小鼠，12只，4周龄，购买于中国科学院上海实验动物中心。

1.2 模型制备 将SAS细胞悬液(1×106细胞/ml)于小鼠右侧背部皮下注射，当移植瘤生长至 100 mm3, 对荷瘤鼠进行治疗。

1.3 治疗方案 体质量相近、背部肿瘤大小均一的BALB/C荷瘤小鼠12只，随机分为2组，对照组6只：未予任何处理；SDT组6只：5-ALA浓度为250 mg/kg，小鼠腹腔注射，避光下饲养孵育4 h 后，超声强度为2.0W/cm2；对皮下肿瘤进行局部超声照射治疗，此操作在黑暗条件下进行，目的为避免光线照射引起动物皮肤炎性反应的发生。每个肿瘤照射时间为5 min，每周1、4治疗，2周后停止。

1.4 观测项目 治疗期间每天均用游标卡尺测量肿瘤的长径和宽径，并计算出肿瘤体积大小，绘制肿瘤生长曲线。用天平测量荷瘤小鼠体质量，并绘制体质量变化曲线。肿瘤体积=(π/6)× A × B2(A和B分别是肿瘤的长、宽径)。

1.5 计算机辅助系统分析 实验染色指标经过Image Pro Plus 6.0软件进行定量转换。用40×目镜下随机选取3个视野拍照，通过软件计算每张图片的积分光密度值，取其平均值作为指标定量数值。所有积分光密度值从小到大排列后分为4等分：积分光密度值0～25%为阴性表达，>25%～50%为弱阳性表达，>50%～75%为中等阳性表达；>75%～100%为强阳性表达。

2 结 果

2.1 肿瘤生长情况 经过治疗，对照组荷瘤鼠肿瘤体积为(810±78)mm3，SDT组肿瘤体积为(432±58)mm3，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。治疗期结束2周时，SDT组肿瘤体积的抑制率为46.67%。见图1。

注：与对照组比较，aP<0.05图1 声动力治疗对肿瘤体积的影响

2.2 体质量变化 对照组小鼠体质量为(24.00±0.58)g,SDT组小鼠体质量为(24.20±0.61)g，2组比较无统计学差异(P>0.05)。见图2。

图2 声动力治疗对小鼠体质量的影响

2.3CD68、IL-10和IFN-γ表达CD68、IL-10和IFN-γ表达于免疫细胞的细胞浆中，呈现棕黄色染色颗粒。CD68出现在移植瘤的周边。IL-10表达主要集中在肿瘤间质中，肿瘤实质细胞中散在中等量的IL-10阳性细胞，经过SDT治疗后肿瘤实质中散在的IL-10几乎消失转而集中在肿瘤边缘表达。值得注意的是，对照组肿瘤发生坏死部位无法充分激活免疫细胞释放IFN-γ，而经过SDT处理后，IFN-γ大量出现在肿瘤碎片中,在不发生坏死的区域内对照组较少表达IFN-γ，SDT组中散在出现IFN-γ阳性细胞(图3见封3)。与对照组比较，SDT组CD68表达水平升高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表达下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表达增高(t=-5.034，P=0.008)。见图4。

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01 图4 2组CD68、IL-10、TFN-γ表达的比较

3 讨 论

声动力治疗是光动力疗法基础之上发展起来的肿瘤治疗方法，一定频率的超声波结合聚集在肿瘤细胞中的声敏剂，可引起肿瘤细胞的凋亡、自噬和坏死的发生。以往关于声动力治疗的研究也主要集中在声动力治疗对肿瘤实质细胞的损伤上。不可否认的是当肿瘤细胞在受到损伤冲击后必定会引起肿瘤微环境免疫系统的震荡。Galon等[16]研究学者发现目前对于肿瘤局部免疫状态的评估是对于预后更加准确的判定指标，对于临床患者的预后评估以及开展肿瘤生物学治疗都具有重要的意义。因此了解SDT治疗对肿瘤微环境免疫状态的影响对SDT深入免疫治疗提供了研究依据。

声动力治疗对肿瘤微环境中的巨噬细胞及其相关因子的研究，检测指标为CD68、IL-10和IFN-γ。首先，通过荷瘤鼠肿瘤大小的变化证实了声动力治疗在抑制肿瘤生长方面具有显著性，声动力治疗引起肿瘤细胞的凋亡、自噬或者坏死。肿瘤细胞死亡引起巨噬细胞的增加是声动力治疗方式引起的主要表现。CD68主要在肿瘤相关巨噬细胞表面表达，通过免疫组化检测CD68发现，肿瘤微环境中的巨噬细胞在声动力治疗后显著增加[17，18]。在以往的研究中发现，CD68的过高表达可能会影响一些肿瘤患者的预后而在另一些肿瘤中则不存在这种意义。这可能与肿瘤微环境中巨噬细胞的性质有关。现有研究已经表明M2型肿瘤相关巨噬细胞的存在可能加强了患者的不良预后。因为CD68也表达在一些M2型肿瘤相关巨噬细胞上，所以单纯检测CD68高表达对抗肿瘤免疫是积极的并不充分；同时Wang等[19]发现在一小部分没有显著M2型巨噬细胞的口腔鳞状细胞癌的患者中，依然存在不良预后的表现，于是我们检测了细胞因子IL-10和IFN-γ。

IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，目前公认为炎性反应与免疫抑制因子，在体内的来源主要是单核巨噬细胞与辅助性T细胞，它能够显著地抑制单核巨噬细胞释放炎性介质，降低炎性反应的规模，在促进肿瘤免疫耐受方面起作用。本研究显示SAS细胞系建立的裸鼠移植瘤模型中，声动力治疗可以较充分地抑制IL-10的释放，这也从侧面说明活动在移植瘤周围的巨噬细胞可能具有更为积极的抗肿瘤作用。在我们建立的B16F10黑色素瘤鼠模型中，发现IL-10在经过SDT后表达也呈现上升[20]。而这种“矛盾”的原因可能为移植瘤所选择的肿瘤细胞系不同，另外更为重要的是多种分泌IL-10的细胞必须受到特定的刺激，受损的组织类型和某种免疫反应的时间点不同也可能是结果不同的原因[21]。

IFN-γ的生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核、巨噬细胞。本结果发现，SDT组中IFN-γ数量出现显著增加，对照组IFN-γ数量较少，在发生坏死的组织周围也极少能观察到IFN-γ。在SDT组，细胞碎片周围散在大量的IFN-γ，这说明虽然2组都表现出肿瘤细胞的死亡，但是经过SDT的介入能够充分地刺激IFN-γ的产生，而IFN-γ的出现是刺激巨噬细胞等相关免疫细胞活化的基础，故在SDT组中CD68表达升高，这说明IFN-γ的高表达极有可能激活了肿瘤微环境中的巨噬细胞表达，而这些巨噬细胞所呈现的性质应为抗肿瘤免疫特质。在下一步的研究中，我们将会观察荷瘤鼠预后情况，以期更加充分说明SDT对荷瘤鼠治疗效果的影响。

总之，声动力治疗作为一种具有前途的方法不仅能够引起肿瘤细胞的死亡，而且还会引起肿瘤免疫的发生。本次实验仅探讨了巨噬细胞和2个细胞因子的变化，初步认定SDT治疗引起的免疫变化是积极的，为开展以声动力治疗为基础的免疫治疗提供一些参考。

(志谢：感谢哈尔滨工业大学声光诊疗室提供的超声治疗仪器)

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Effect of sonodynamic therapy on tumor mircoenvironment macrophages in SAS bearing mice

WANGXiaolong*,WANGShan,ZHENGJinhua,GUOFulin.

*DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,ChinaCorrespondingauthor:GUOFulin,E-mail:Flguo1967@126.com

Objective To detected the changes in the number of macrophages in tumor bearing mice in the tumor microenvironment and cytokine before and after sonodynamic therapy.Methods Selected 12 BALB/C miceto establish tumor model, they were randomly divided into 2 groups, 6 rats in the control group, without any treatment; 6 rats in SDT group, mice were given intraperitoneal injection of 5 ALA (250 mg/kg), and ultrasound irradiation, ultrasonic intensity was 2.0 W/cm2; 2 weeks after stopping treatment, the growth of tumor and tumor bearing mice body weight changes were detected, and immunohistochemical staining was used to detect changes of CD68 and cytokine IFN-γ and IL-10 level.Results At the end of the treatment period of 2 weeks, the control group rats’ tumor volume was (810±78) mm3, SDT group was (432±58) mm3, SDT group’s tumor volume inhibition rate was 46.67%.Body weights of the control group mice was (24.00±0.58) g, SDT group mice was (24.20±0.61) g, the difference between the 2 groups had no statistical significance (P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionlevelofCD68inSDTgroupwasincreased(t=-3.756,P=0.032),IL-10expressionwasdecreased(t=8.015,P=0.01),expressionofIFN-γwasincreased(t=-5.034,P=0.008).Conclusion Sonodynamic therapy can change the number of cytokines in the tumor microenvironment of macrophage.

Sonodynamic therapy; Tumor microenvironment; Macrophages;BALB/C rats

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.11511168)

150001 哈尔滨医科大学附属口腔医院口腔颌面外科(王晓龙、郭福林)； 哈尔滨医科大学基础医学院解剖学教研室(王姗、郑金华)

郭福林，E-mail:Flguo1967@126.com

2014-11-21)