海州常山花粉活力测定及其萌发条件1)

林燕青 杨秀莲 王良桂

(南京林业大学，南京，210037)

责任编辑:任 俐。

海州常山(Clerodendrum trichotomum Thumb．)为马鞭草科(Verbenaceae)大青属(Clerodendrum L．)小乔木或灌木［1］。花序大，花果艳丽，花、花萼、果可共存于同一树上，白、红、兰3种颜色交替生辉，观赏期长达半年，是既可观花，又可冬季观果的优良花木［2－3］。海州常山还具有较强的抗旱、耐瘠薄、耐盐碱能力，是一种很有潜力的城市废弃地恢复植物种。此外，海州常山的茎叶均具有一些重要的药用成分［4］，可以医治肿瘤、高血压等多种疾病，是一种极具经济价值的野生植物，极具开发潜力。

近年来，有关海州常山的研究多集中在其抗性机理方面，鲜有海州常山花粉的相关研究。花粉是植物重要的种质材料，其活力直接影响到植物的遗传、育种、进化、生殖等的效率和能力［5－7］。花粉活力的研究对人工授粉和杂交育种，解决花期不遇等问题具有极其重要的意义。

花粉生活力的测定常用的方法有:花粉直接授粉、花粉人工萌发和花粉染色法鉴定等［8］。文中对多种花粉活力测定方法进行了比较研究，筛选出了最适宜于海州常山花粉活力测定的方法，探究了海州常山花粉萌发的最佳培养基及最佳培养条件。同时比较了海州常山花期及花粉采集时间对其花粉萌发率的影响。旨在探究保持较强海州常山花粉活力及花粉达到最佳萌发效果所需条件，为海州常山的种质资源保存及育种提供参考。

1 材料与方法

用于研究花粉活力及萌发条件的材料来自江苏盐城海州常山基地，研究花粉活力测定方法、花期及花粉采集时间对花粉萌发影响的材料来自南京林业大学校园及南京紫金山，采集时间为2014年8月中下旬。

用移液枪分装0．1 mL液体培养基于每个双孔凹玻片孔内，使用牙签将待试花粉均匀点入培养液中，使其充分混合，将凹玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25℃光照人工气候箱中培养6 h。在40倍电镜下观察统计花粉萌发率，每处理统计3个视野，每个视野花粉粒数不少于50粒，每试验3个重复，花粉萌发以花粉管长度大于花粉粒直径为标准［9－10］。

花粉萌发率=(萌发的花粉粒数/花粉粒总数)×100%。

花粉萌发法:设置不同质量浓度糖溶液，包括淀粉、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖，质量浓度梯度均为0、50、100、150、200、300 g·L－1，筛选最适宜于海州常山花粉萌发的糖因子。硼酸质量浓度梯度设置为0、50、100、200、300、500 mg·L－1，氯化钙质量浓度梯度设为0、50、150、250、350、500 mg·L－1，确定最佳单因子培养基［11］。

将各质量浓度梯度硼酸及氯化钙液体培养基分别配置其pH值为5．5、6．0、6．5，培养海州常山花粉6 h，观察统计其萌发率，研究比较硼酸及氯化钙的pH值与质量浓度对花粉萌发率的交互作用［11］。

在单因子试验的基础上，进行L25(53)正交试验［11－12］，与最佳单因子组合相比较，选取对海州常山花粉萌发影响最大的培养基组合。

在最佳培养基的基础上，设置以下4个方案来探究海州常山花粉最佳培养条件:于25、35、45℃黑暗条件下培养花粉6 h，观察统计花粉萌发率，探究短时高温对花粉萌发率的影响;将海州常山花粉于黑暗与光照下培养6 h，比较花粉萌发状况，研究光照条件对海州常山花粉萌发率的影响;分别培养花粉2、4、6、8、10、12、24 h，确定海州常山花粉最适宜的培养时间;将同样的花粉均匀分为6份，分别放置于铺有玻璃纸的培养皿中，放入烘箱25℃，分别干燥1、3、6、9、12、24 h后取出，待其温度达到室温，培养干燥后的花粉，统计花粉萌发率，确定海州常山花粉最适宜干燥时间［11－12］。

花粉活力测定方法:花粉活力测定采用染色法和离体培养法，染色法有碘－碘化钾染色法、TTC染色法、联苯胺染色法。离体培养法有无机酸刺激花粉管伸长的硫酸(质量分数梯度为7．2%、14．4%、28．0%)培养法和液体萌发法［13］。

花期及花粉采集时间对花粉萌发率的影响:选择晴朗的天气，分别采集花蕾期、开花第1天～第2天、开花第3天、花谢后的海州常山花粉进行液体培养，统计花粉萌发率，确定采集海州常山花粉的最佳时期［6］。分别在同一天的08:00、12:00、16:00采集盛花期且生长健壮植株的花粉，收集于聚乙烯离心管中，迅速带回实验室培养并测定其萌发率，确定海州常山花粉采集的最适时间。

数据统计分析:测定数据使用EXCEL及SPSS19．0软件进行处理。

2 结果与分析

2．1 海州常山花粉活力测定方法的分析比较

本试验采用3种染色法(TTC、联苯胺、碘－碘化钾染色法)和2种离体培养法(液体培养法、硫酸培养法)测定海州常山花粉活力。试验结果显示，染色法测定海州常山花粉活力效果并不明显，海州常山花粉为深紫色，所以采用染色法无法区分出花粉是否被染色，不适宜用于海州常山花粉活力的测定。由表1显示，经无机酸培养法测定的海州常山花粉活力极显著低于经液体培养法测定的花粉活力，经14．4%质量分数硫酸测定的花粉活力为27．12%，相对较高;经7．2%质量分数硫酸测定的花粉活力为14．23%;经28．0%质量分数硫酸处理造成了花粉细胞的质壁分离，萌芽率为7．84%;试验采用14．4%质量分数的硫酸测定花粉的活力。液体培养法(150 g·L－1蔗糖溶液)测定的海州常山花粉活力为72．27%，可以直接观察花粉管的发育情况，能较好地反映花粉的萌发率。故采用液体培养法可更准确的测定海州常山花粉的活力。

表1 液体培养法与硫酸培养法测定海州常山花粉活力比较

2．2 单因子对海州常山花粉萌发的影响

2．2．1 不同糖因子对花粉萌发率的影响

由表2显示，5种糖因子中，经质量浓度为150 g·L－1蔗糖培养的花粉萌发率最高，达到22．84%，与经葡萄糖、淀粉、乳糖及麦芽糖培养的花粉萌发率差异均显著，可知150 g·L－1蔗糖可以更加有效地提高海州常山花粉的萌发率。

表2 不同质量浓度各种糖因子对海州常山花粉萌发率的影响

2．2．2 单因子对花粉萌发率的影响

硼酸、蔗糖、氯化钙对海州常山花粉萌发均有显著作用。质量浓度为200 mg·L－1的硼酸溶液可以极显著地提高花粉萌发率，达到20．04%，且与经其他质量浓度的硼酸溶液培养的花粉萌发率差异均极显著;经500 mg·L－1硼酸溶液培养的花粉萌发率为8．81%，与对照组(蒸馏水)所培养花粉的萌发率(4．35%)差异不显著;经其余质量浓度的硼酸培养的花粉萌发率均与对照组差异呈显著水平。经150 mg·L－1氯化钙溶液培养下的花粉萌发率达到22．27%，极显著的高于经0、50、250、350、500 mg·L－1氯化钙溶液培养下的花粉萌发率，后五者之间差异均不显著。150 g·L－1蔗糖溶液可极显著的提高花粉萌发率，达到22．84%，与经0、50、100、200、300 g·L－1蔗糖溶液培养下的花粉萌发率差异均呈极显著水平。由此可见，适宜浓度的硼酸、氯化钙、蔗糖溶液均可有效提高花粉萌发率，质量浓度过低或过高的培养液会抑制花粉的萌发。

2．2．3 不同质量浓度、pH值硼酸和氯化钙对花粉萌发率的影响

由表3可以看出，当硼酸质量浓度为50～200 mg·L－1时，花粉萌发率随着硼酸质量浓度的增大而逐渐升高，但随着pH值的升高而降低，可见硼酸质量浓度为200 mg·L－1，pH=5．5的情况下花粉萌发率最高。

当氯化钙质量浓度为150 mg·L－1、pH=5．5的情况下花粉萌发率较显著高于其他两种pH值下的萌发率。结合2．2．2的结论，可以得出硼酸及氯化钙pH值对花粉萌发率的影响没有其质量浓度对萌发的影响显著，且硼酸和氯化钙溶液的pH值为5．5时，更适宜海州常山花粉的萌发。

表3 不同质量浓度、pH值硼酸和氯化钙对花粉萌发率的影响

2．3 蔗糖、硼酸、氯化钙三因子正交试验结果

由表4显示，第1到第25组为正交试验组合，第26组为2．2．2得出的最佳单因子组合。正交试验结果显示，海州常山花粉在第23组(蔗糖200 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化钙150 mg·L－1)培养基配方下的花粉萌发率是最高的，达到22．02%。其次为第18组(蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化钙50 mg·L－1)培养基配方下的花粉萌发率，为20．57%。在2．2．2试验的基础上，蔗糖、硼酸、氯化钙最佳单因子的组合(第26组:蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化钙150 mg·L－1)培养基配方下的花粉萌发率达到28．07%，与正交组合的第23组培养基下花粉萌发率差异不显著外，与其他正交组合的花粉萌发率均达到极显著差异。

综上所述，海州常山花粉离体培养的最佳液体培养基配方为最佳单因子组合:蔗糖150 g·L－1+硼酸200 mg·L－1+氯化钙150 mg·L－1。

表4 海州常山花粉正交试验的萌发率

2．4 不同培养条件对花粉萌发率的影响

光照条件的选择:在光照及黑暗条件下培养海州常山花粉，比较其萌发率，探究光照条件对海州常山萌发的影响。试验结果显示，光照条件下培养的海州常山花粉萌发率为24．32%，黑暗培养的海州常山花粉萌发率为21．10%，可见光照条件下培养海州常山花粉萌发率略高于黑暗培养的花粉萌发率。

培养时间的选择:海州常山花粉在培养8 h后其萌发率基本不再变化，且出现断芽及模糊现象。海州常山花粉在培养不同时间段后，花粉萌发率差异显著。培养8 h的花粉萌发率达到最高，为27．99%，且极显著地高于培养2、4 h后的花粉萌发率，而与培养6、10、12、24 h下的花粉萌发率差异均不显著。可知海州常山花粉培养的最佳时间为8 h。

培养温度的选择:在高于25℃的高温条件下海州常山花粉萌发率达到21．01%，且随着温度的升高而极显著下降，温度升高为35、45℃时，萌发率分别下降为14．06%、10．01%。可见温度太高会对海州常山花粉活力造成破坏，不利于花粉的萌发。因此，海州常山花粉萌发的适宜温度为25℃。

最佳含水量的选择:海州常山花粉干燥1～9 h时，花粉萌发率随着干燥时间的延长而不断提高，干燥9 h以后花粉萌发率呈下降趋势。干燥9 h后花粉萌发率达到最高，为25．35%，与干燥6 h的花粉萌发率(21．01%)差异不显著外，与其他干燥时间下的花粉萌发率均达极显著水平。干燥9 h后花粉萌发率与不进行干燥处理的花粉萌发率(16．12%)达显著水平。由试验结果可得，海州常山花粉在25℃条件下干燥9 h较适宜。

2．5 海州常山花期与花粉采集时间对花粉萌发率的影响

为探究海州常山花粉采集的最佳时间，本试验在不同花期及一天中不同时间采集海州常山花粉，进行离体培养，统计其萌发率。试验结果显示，花蕾期的花粉萌发率为72．43%，与开花第1～第2天花粉萌发率(79．28%)差异不显著，但均与开花第3 d花粉萌发率(56．02%)差异极显著。花谢后其花粉萌发率(8．70%)与前3种情况下的花粉萌发率差异均达极显著水平。可见在花蕾期及开花2 d内花粉活力相对较高，开花第1～第2 d时花粉活力最强。

于08:00采集的海州常山花粉萌发率为75．20%，12:00采集的海州常山花粉萌发率为62．24%，二者差异不显著，但均与16:00采集的海州常山花粉萌发率(41．73%)有极显著差异。随着1 d中时间的延续，花粉萌发率显著下降，从而得出，海州常山花粉活性在1 d中的08:00较高。可知海州常山的花粉采集及人工野外辅助授粉等作业适宜在08:00进行，此时花粉活力较强。

3 结论与讨论

糖类物质在花粉萌发和花粉管生长中起着重要的作用，蔗糖起着维持花粉与培养基之间渗透平衡的作用，也是花粉萌发的营养物质和能量来源［14］。在花粉萌发过程中，硼酸具有增加糖的吸收、转运和代谢，帮助形成胞外Ca2+梯度，促进花粉萌发和花粉管生长等作用［15］。钙离子主要是在蔗糖和硼酸的主导作用下起辅助作用，而这种作用对启动花粉萌发和调节花粉管生长是必须的［16］。由试验得出，空白对照下海州常山花粉萌发率为3．75%，150 g·L－1蔗糖培养下海州常山的花粉萌发率显著提高到22．84%，200 mg·L－1硼酸下海州常山花粉萌发率达到20．04%，与大花蕙兰［17］(Cymbidium hybridium)相同，150 mg·L－1的氯化钙显著提高了花粉萌发率。试验中，经150 mg·L－1氯化钙培养下的花粉萌发率达到22%，相对于硼酸及氯化钙质量浓度对花粉萌发率的影响，其pH值对海州常山花粉萌发率的影响并不显著。海州常山花粉在硼酸及氯化钙pH值为5．5时其萌发率较pH值为6．0、6．5的情况下萌发率高。

正交试验中蔗糖、硼酸、氯化钙之间的交互作用并不明显，但由单因素试验所选出的最佳质量浓度单因子组合150 g·L－1蔗糖+200 mg·L－1硼酸+150 mg·L－1氯化钙则可显著提高花粉萌发率，蔗糖和硼酸对海州常山花粉的萌发起最主要作用，钙离子次之。

培养条件不同，海州常山花粉萌发率也达到显著不同，与黄连木(Pistacia chinensis)［18］、无距虾脊兰［19］相同，海州常山花粉最适宜萌发温度为25℃，可见海州常山花粉采集及野外授粉等活动适宜在25℃温度条件下进行。

一定的含水量对花粉的萌发率及低温贮存有重要的意义，试验中海州常山在烘箱中25℃干燥9 h可显著提高花粉萌发率，超过9 h其活力显著下降。由此可见，采集的海州常山花粉不适宜长时间暴露在外。广玉兰［20］花粉培养2 h，楸树花粉［21］培养6 h，其花粉萌发状态最佳，试验中海州常山花粉需要培养8 h达最佳萌发状态，可能因为不同植物花粉的结构与适应性有差异，因此，所需培养时间也不同。

花粉生活力的测定在育种和种质保存中具有重要意义［22－23］。本试验中，染色法对海州常山花粉的染色效果不佳，海州常山花粉自身为深紫色，使用染色法测定活力很难区分其是否被染色，有效且可快速测定海州常山花粉活力方法为液体培养法。海州常山活力的测定较适宜的染色法仍需要进一步的试验研究。

花粉在不同的发育时期其活力显著不同，试验得出海州常山在开花第1～第2天其花粉萌发率达到最高。1 d中海州常山花粉活力也是不同的，在08:00花粉活力较强，萌发率较高，随着时间的延续，海州常山花粉活力不断的降低。因此，收集花粉及人工辅助授粉适宜在花期1～2 d完成，于08:00进行效果较好。试验中于南京采集的海州常山花粉萌发率远大于从盐城试验基地所采集海州常山的花粉萌发率，可知长距离及长时间的携带对海州常山花粉萌发率影响较大。

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