落叶松林地土壤4种酚酸对水曲柳幼苗生长的影响1)

袁慧 张洁 杨立学

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

责任编辑:王广建。

植物和植物之间以次生代谢生物质为媒介，普遍存在着化学作用关系［1］，植物也是次生代谢物质的主要来源［2］。在生态系统中，化感作用是普遍现象，而并非特例，混交林中更是如此。现有研究表明，植物种间种内普遍存在着化感作用，化感作用是影响人工混交林能否成功的重要因子之一［3］。

水曲柳(Fraxinus mandshurica)和落叶松(Larix gmelinii)是我国东北林区的重要用材树种，两者组成的混交林是非常成功的混交类型，水曲柳始终表现出增产效应。对于水曲柳和落叶松混交增产的机制，一些研究强调混交林中的营养和空间的竞争作用，主要对土壤的理化性质、种间营养关系［4］、混交林树种的生理特性、混交林生态条件［5］、地下根系的生长关系［6］等方面进行研究;也有研究发现落叶松的挥发物及枯落物能够促进水曲柳的生长［7－8］。化感物质是植物种内、种间化感作用的特定化学物质，研究已证实落叶松根系可以向土壤中分泌低分子量化合物(芳香酚酸类物质等)和高分子化合物(多糖、蛋白质等)［9－10］。已有研究表明游离性酚酸对于某些植物具有一定的化感作用［11－12］。本研究采用室内盆栽试验的方法，通过测定水曲柳－落叶松混交林地落叶松根际与非根际土壤中4种酚酸(2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素、阿魏酸和松香酸)不同季节的质量分数，研究这4种酚酸对水曲柳幼苗生长的影响。为进一步探讨水曲柳－落叶松混交林增产的机制及其种间相互作用关系提供新的依据。

1 研究地概况

研究地点位于东北林业大学帽儿山实验林场尖砬沟实验站，地理坐标为东经127°30'～127°34'、北纬45°21'～45°25';地貌类型属于低山丘陵，平均海拔为300 m;属寒温带大陆性季风气候区，年均气温2．8℃，年降水量723．8 mm，无霜期120～140 d。地带性土壤为暗棕壤，土壤厚度40～45 cm。所选水曲柳与落叶松混交林为1987年营造，调查时尚未间伐。

2 研究方法

2．1 取样方法

分别于2011年4月下旬、6月中旬及8月中旬，取水曲柳落叶松混交林地落叶松根际土与非根际土。林地内设置3块5 m×6 m的样方，样方间距大于15 m，所选样方内坡度、坡向、土壤类型等立地条件基本一致，每个样方四角做好标记便于取样，每个样方内选取4个样点收集落叶松的根际土与非根际土并分别混装。选择土层0～20 cm范围内的落叶松根系，用铁铲割断，除掉根系上较大土块，挑选细小根系并抖落上面附着土壤作为试验用非根际土的样本，再用镊子小心收集粘在根系表面5 mm范围内的土壤作为根际土的样本。最后去除取出土样中的植物根系、土壤动物、碎石及其它可见直径较大的杂质，密闭封装并放置于加冰袋的保温箱中冷藏。取回的土样先做冷冻干燥处理，然后经2 mm孔径过筛，保存于冰箱中，为酚酸质量分数分析做准备。

2．2 盆栽实验设计

供试水曲柳幼苗选自吉林省临江林业局中心苗圃。2011年4月，选取生长一致，1年生水曲柳幼苗栽植于塑料桶中，每桶1棵。塑料桶上部直径40 cm、下部直径35 cm、高40 cm。栽培基质为落叶松－水曲柳混交林土壤并伴以细沙，土壤与细沙的质量比为3∶1。因为林地土壤中酚酸实测的质量分数是以土壤质量为标准(μg/g)，而试验中施加的酚酸的溶液，质量浓度标准为g/L。为了保证施加的酚酸的质量与实测的一致，每份盆栽基质均统一称10 kg放置于东北林业大学温室中进行培养。

本实验所用的2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素、阿魏酸和松香酸4种供试试剂均购买自上海晶纯试剂有限公司，试剂标准品均为分析纯，其纯度≥99%。施加每种物质的质量浓度均以1．0 g/L的原液加蒸馏水稀释配制而成。每次施加200 mL不同质量浓度的溶液。同时，每隔10天向苗木喷洒蒸馏水保持土壤润湿。按照不同的季节，对水曲柳幼苗施加4种落叶松根际和非根际土的不同质量浓度的酚酸溶液，10月中旬培养结束，测定幼苗苗高、地径、生物量、菌根侵染率和根系活力。

本次试验根据2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素、阿魏酸和松香酸在落叶松根际土和非根际土中的质量分数不同(见表1)设置A、B两组。每组根据4种物质的不同组合，设置15个处理，并设置对照(CK)，每个处理7次重复，共计112盆水曲柳幼苗。试验分组详见表2。

2．3 测定方法

酚酸质量分数的测定:采用高效液相色谱法测定，详细步骤及色谱参数参照苏金豹等［12］人的方法。

菌根侵染率测定:采用Trypan blue染色法测定［13］。

根系活力测定:用α－萘胺氧化法测定［14］。以鲜质量1 g根系1 h氧化的α－萘胺的微克表示根系活力(μg·g－1·h－1)。

苗木生物量:水曲柳幼苗收获后，测定苗高、地径及干生物量(分别取水曲柳苗的地上和地下部分，用清水冲洗干净，80℃烘箱中烘干至恒质量)，计算平均值。

数据处理:数据统计分析采用SPSS19．0软件，单因素方差分析采用LSD法(α=0．05)。

表1 落叶松林地土壤酚酸质量分数 μg·g－1

3 结果与分析

3．1 4种酚酸对水曲柳幼苗苗高、地径、生物量的影响

施加4种酚酸后，不同处理之间水曲柳幼苗的苗高、地径、生物量差异较大，施加落叶松根际土酚酸质量分数的处理见表3。2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸、7－羟基香豆素+阿魏酸、阿魏酸+松香酸处理的苗木的苗高分别比对照增加了6．44、9．81、5．20 cm，按百分比计算，分别高出了25．25%、38．51%、20．48%，显著达到差异水平(P＜0．05)，表现为促进作用;阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸+松香酸处理的苗高则显著低于对照，分别比对照降低了7．56、13．40、7．90 cm，按百分比计算，分别降低了30．35%、52．56%、30．98%，表现为抑制作用;7－羟基香豆素+阿魏酸处理的苗高达到最大，比对照高出了9．84 cm(38．54%)。经2，4－二羟基苯甲酸+松香酸处理的最小，比对照低13．40 cm(47．51%)，差异极显著(P＜0．01)。相比于根际土质量分数的酚酸处理的苗高，施加非根际土质量分数的酚酸处理的苗高结果差异波动不大(见表4)，表现为抑制作用。根际土酚酸质量分数和非根际土酚酸质量分数的2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸+松香酸处理的苗高与对照相比均表现为抑制作用。

从表3～4可知，除了2，4－二羟基苯甲酸+松香酸处理的地径低于对照，分别降低了1．79、1．52 mm，按百分比计算，分别降低了25．43%、22．96%，差异达到显著水平，其它处理对地径的影响与对照相比，均略有降低或者一致，差异不显著。

表2 试验分组序列表 g·L－1

表3 根际土酚酸质量分数处理的水曲柳幼苗的各项指标

由表3可知，根际土的酚酸(2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素、阿魏酸、松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸)对水曲柳幼苗生物量的影响，显著高于对照组，分别增加了11．33、20．09、9．94、15．05、11．82、9．8 g，按百分比计算，分别增加了56．39%、58．34%、49．48%、74．91%、58．84%、48．78%，表现为促进作用;除了7－羟基香豆素+阿魏酸、阿魏酸+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸组合处理的幼苗生物量与对照组无明显差异外，其他处理组均表现为抑制作用;其中松香酸比2，4－二羟基苯甲酸+松香酸处理的幼苗生物量高出了25．38 g(260．04%)，差异极显著(P＜0．01)。

非根际土酚酸质量分数的处理中(见表4)，除了2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素、松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸、7－羟基香豆素+松香酸与对照组无明显差异外，其余组相比对照均表现为抑制作用，其中阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、阿魏酸+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+松香酸、7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸组合分别比对照降低了7．31、6．74、6．62、8．62、6．86、8．03，按百分比计算，分别降低了48．79%、44．98%、57．53%、45．81%和53．62%，差异显著。根际土酚酸质量分数和非根际土酚酸质量分数的2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、7－羟基香豆素+松香酸和7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸处理的生物量比对照均表现为抑制作用。

3．2 4种酚酸对水曲柳幼苗根系活力的影响

在根际土酚酸质量分数与非根际土酚酸质量分数的处理中，水曲柳幼苗根系活力之间差异显著(见表3～4)。根际土酚酸质量分数的处理中，2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸、7－羟基香豆素+阿魏酸、7－羟基香豆素+松香酸和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸等组合分别比对照增加了29．38%、89．18%、22．68%和40．72%，表现为促进作用;而2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸显著低于对照，分别降低了54．64%和48．45%，表现为抑制作用;其中水曲柳幼苗根系活力最大值(7－羟基香豆素+阿魏酸)比最小值(2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸)高出了267．32%，差异极显著(P＜0．01)。

非根际土酚酸质量分数的处理中，大部分处理表现为促进作用，其中阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+松香酸、2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸+松香酸和7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸分别比对照增加了14．41%、12．89%、18．65%、44．32%和14．95%，差异显著;而2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素、2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、7－羟基香豆素+阿魏酸和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸与对照相比均降低了30%左右，表现为抑制作用。其中水曲柳幼苗根系活力最大值(2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸+松香酸的组合处理)比最小值(2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素的组合处理)增加了114．76%，差异显著。根际土酚酸质量分数和非根际土酚酸质量分数的2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸与对照相比均表现为抑制作用，而2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸却表现为促进作用。

3．3 4种酚酸对水曲柳幼苗菌根侵染率的影响

在根际土酚酸质量分数与非根际土酚酸质量分数的处理中，水曲柳幼苗菌根侵染率之间差异显著(见表3～4)。根际土酚酸质量分数的处理中，2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸的处理分别比对照高出了31．79%和12．26%，表现为促进作用;而2，4－二羟基苯甲酸、7－羟基香豆素+阿魏酸、阿魏酸+松香酸和7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸等组合处理显著低于对照，分别降低了47．98%、30．12%、30．43%和24．48%，表现为抑制作用;其中水曲柳幼苗菌根侵染率最大值(2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素)比最小值(2，4－二羟基苯甲酸)高出了151．66%，达到极显著(P＜0．01)。

非根际土酚酸质量分数的处理中，大部分处理表现为促进作用，其中2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸比对照高出了59．58%(P＜0．01);只有松香酸和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素显著低于对照，均降低了17%左右，表现为抑制作用。其中水曲柳幼苗菌根侵染率最大值(2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸)比最小值(2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素)高出了96．63%(P＜0．05)。根际土酚酸质量分数和非根际土酚酸质量分数的2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸相比对照均表现为促进作用。

4 结论与讨论

植物种内、种间的地下化学生态学关系受到物种类型、化感物质的合成及释放途径、物质的有效质量分数和土壤的营养条件及其他环境因子等多方面影响。

试验中不同的组合处理对水曲柳幼苗生长的影响差异较大，说明水曲柳幼苗对不同物质的反应不尽相同。施加2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸、7－羟基香豆素+阿魏酸、阿魏酸+松香酸的组合处理显著促进水曲柳幼苗的生长;而施加2，4－二羟基苯甲酸+松香酸、7－羟基香豆素+松香酸和7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸处理对水曲柳幼苗的生长却有显著的抑制作用。曹光球等［15］研究发现不同质量分数阿魏酸对杉木种子萌发与胚根生长有不同程度抑制作用，随质量分数降低，抑制作用逐渐减弱，而且阿魏酸的抑制作用较肉桂酸强，表明酚酸物质的种类不同对植物体的所用效果也不一样。郭亚丽等［16］研究在高质量分数阿魏酸和香豆素抑制作用下，抑制铜绿微囊藻细胞的生长，但是低质量分数下却显著促进铜绿微囊藻细胞的生长，认为低质量分数的化感物质能够改变细胞膜的通透性，使植物体更易吸收溶液中营养成分。但是种子发芽实验结果表明，阿魏酸较香豆素毒性小，认为产生的差别可能与两者的化学结构不同有关，也可能因为两者对铜绿微囊藻的作用靶点不同而表现出不同的抑藻效果。本研究中试验酚酸的质量分数较前人的研究明显降低，但并未得出相似的结论，可能是试验受体的选择与试验环境的差异的原因。试验中4种物质单独处理的结果表明，除了对水曲柳幼苗的苗高略有区别外，对地径和生物量的影响并没有差异，但是部分组合处理之间差异显著。从目前的研究来看，还鲜见相关酚酸物质间组合处理对植物体影响的报道。Sturz等［17］研究根际细菌的试验发现，虽然个体菌种抑制植物生长，但是混合培养的菌种却能够刺激植物生长，认为细菌种群在寄主植物上建立的合作关系，影响着植物生长。我们能从中得到启发，可能不同酚酸物质之间在土壤的环境中存在着某种协同作用的关系，而这种协同作用的结果对植物体产生了有利或有害的影响。

植物的根系活力是泛指根的吸收能力、合成代谢等，其活力大小与吸收作用的强弱有着直接的关系。陈龙池等［18］发现对羟基苯甲酸降低杉木幼苗的根系活力，影响杉木幼苗对养分的吸收，认为酚类物质是影响杉木幼苗生长的原因之一;顾元等［19］施加酚酸溶液于水稻幼苗，结果也得出了对幼苗生物量的累积、根系活力、叶绿素质量分数产生低质量分数促进，高质量分数抑制作用。Chon等［20］研究发现，相对于地上部分，根部对化感物质的反应更加敏感。试验中，施加2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸组合处理显著抑制水曲柳幼苗的根系活力，施加2，4－二羟基苯甲酸+阿魏酸的处理反而促进了根系活力，说明7－羟基香豆素在2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸组合中对根系活力可能起到了强烈的抑制效果，但是7－羟基香豆素单独作用下对根系活力并没有产生任何作用。有研究报道［21］香豆素化合物处理均能促进水稻幼苗的生长，本试验并未得出相应的结果。

菌根侵染率与土壤的有机质质量分数和土壤pH有关。于强波等［22］研究了地面覆盖有利于越橘的根系活力和菌根侵染，认为地面覆盖增加了土壤的有机质质量分数，还保持了较低的土壤pH，为菌根的侵染创造了良好的条件。试验中，2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素、2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸和2，4－二羟基苯甲酸+7－羟基香豆素+阿魏酸+松香酸的组合处理显著促进水曲柳幼苗的菌根侵染率，可能对菌根真菌提供了适宜生长的土壤理化环境。2，4－二羟基苯甲酸却显著降低了菌根侵染率，也许对菌根真菌有毒害作用，但是令人信服的作用机制还未见报道。

本文研究了在基质培养中添加4种酚酸对水曲柳幼苗生长的影响，但在复杂的野外土壤生态条件下，酚酸类物质的化感活性受很多外界因素的影响，如自由态酚酸物质的质量分数、土壤pH值、微生物活性等。因此，在自然生态条件下植物地下生态化学作用的机理有待进一步研究。

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