梅花PmAP2基因的克隆及表达1)

徐宗大 郝瑞杰 杨炜茹

(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学)，北京，100083) (城乡生态环境北京实验室(北京林业大学))

程堂仁 王佳 张启翔

(国家花卉工程技术研究中心(北京林业大学)) (城乡生态环境北京实验室(北京林业大学))

责任编辑:任 俐。

花发育一直是观赏植物研究的重点，前人通过拟南芥等模式植物的研究，提出了植物花器官发育的ABC模型、ABCE模型及四因子模型［1－3］。在拟南芥中，A功能基因包括APETALE1(AP1)和APETALE2(AP2)，它们控制着萼片和花瓣的发育［4］。其中AP2基因编码属于AP2/ERF家族的转录因子，除参与花分生组织建立和花器官发育外，AP2基因还调控了种子的发育［5－6］。此外，AP2基因在营养器官中也有表达，但其突变体对营养器官的表型没有影响［7］。

梅花(Prunus mume Sieb．et Zucc．)是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)重要的观赏花木与果树，为中国十大传统名花之一。在长期的栽培及人工育种过程中，梅花形成了单瓣、重瓣、台阁、飞瓣、多萼片、多雌蕊等花型［8］。这些丰富的花型既增加了梅花的观赏价值，也为研究植物花器官发育提供了良好的材料。然而，对梅花花器官发育基因的相关研究鲜见报道，梅花花发育的分子机理尤其是不同花型形成的机理尚不明确。鉴于AP2基因在植物花器官发育尤其是萼片和花瓣发育中具有重要的功能，本研究对梅花AP2基因进行了克隆，并对其在梅花不同器官(营养器官和花器官)、不同花型(单瓣、重瓣、台阁)品种中的表达模式进行研究，以期明确PmAP2基因在梅花花器官发育及花型形成中的功能，为通过分子生物学手段改良梅花花型奠定基础。

1 材料与方法

试验于2014年在花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学)进行。以‘三轮玉蝶’(Prunus mume‘Sanlun Yudie’)花蕾为试材，提取总RNA用于基因克隆;取‘三轮玉蝶’根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、未成熟果实等材料进行基因的组织特异性表达分析;以单瓣品种‘江梅’(Prunus mume‘Jiangmei’)、重瓣品种‘三轮玉蝶’和台阁品种‘素白台阁’(Prunus mume‘Subai Taige’)的花蕾为材料，研究基因在不同花型梅花花蕾的表达差异。所有材料液氮速冻后－80℃保存。

总RNA提取及第一链cDNA合成:将试验材料在液氮中研成粉末后，采用百泰克公司的RNApure高纯总RNA提取试剂盒提取总RNA。经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA质量后，以2μg总RNA为模板，采用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒合成第一链cDNA。操作方法参照试剂盒说明书进行。

PmAP2基因克隆:以拟南芥AP2蛋白序列(NP_195410．1)为种子，在梅花基因组蛋白库中进行本地BLAST搜索，将同源性最高的序列作为候选基因。根据基因核苷酸序列设计引物，扩增基因的编码区(CDS)。以梅花cDNA为模板进行RT－PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，采用Promega Gel extraction kit DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接到pMD18－T(Takara)载体上，转化大肠杆菌Top10，挑取阳性克隆经PCR验证后，交由中美泰和生物技术有限公司测序。

PmAP2基因序列分析:将克隆得到的序列提交到Interprto网站(https://www．ebi．ac．uk/interpro/)上进行保守结构域分析;采用DNAMAN软件对PmAP2蛋白与其他物种AP2蛋白进行比对分析;用EXPASy的ProtParam程序(http://web．expasy．org/protparam/)分析PmAP2蛋白的相对分子质量、理论等电点以及疏水性;将克隆得到的核苷酸序列提交到psRNATarget网站(http://plantgrn．noble．org/psRNATarget/?function=2)上进行miRNA靶位点预测;采用clustalX［9］进行多序列比对，利用MEGA6软件采用N－J方法构建系统进化树［10］，bootstrap值设为1 000次。

实时荧光定量RT－PCR:分别提取样品的总RNA，反转录成cDNA，作为real－time RT－PCR的模板。反应采用20μL体系，即cDNA 2μL，SYBR Premix Ex Taq(Takara)10μL，上下游引物(10μmol·L－1)各0．4μL，ddH2O 7．2μL。反应程序为95℃预变性30 s;95℃变性5 s，60℃延伸30 s，40个循环。扩增产物特异性通过溶解曲线进行确定，试验设置3次生物学重复和3次技术重复。结果与分析采用2－ΔΔCt法，以梅花PP2A基因作为内参基因［11］，引物序列见表1。

表1 梅花PmAP2基因克隆及表达所用引物序列

2 结果与分析

2．1 PmAP2基因的克隆与序列

以梅花花蕾cDNA为模板进行PCR扩增，经连接、转化、测序后，得到长为1 647 bp的CDS序列(图1)。BLAST分析表明，该基因与多种植物AP2基因有较高的同源性，其中与桃AP2基因的相似性最高，为96%，与苹果AP2基因的相似性为82%。CDS编码一个由548个氨基酸组成的蛋白质，其相对分子质量为57．75 kD，理论等电点为6．04，为亲水性蛋白。Interpro分析表明，此蛋白含有AP2蛋白特有的两个保守的AP2结构域，并且在第一个AP2结构域上游有一个核定位信号，这些特征与其他物种AP2蛋白一致(图1)［12－13］。将该基因命名为PmAP2，Genebank登录号为KP405836。将得到的CDS序列提交到植物miRNA靶基因预测网站psRNATarget进行序列分析，发现在3’端有一个miR172结合位点(图1黑框中序列)，说明PmAP2的表达可能受miR172的调控。

2．2 蛋白质多序列比对及系统进化

采用DNAMAN将得到的PmAP2蛋白与其他植物AP2蛋白进行多序列比对发现，11种植物的AP2蛋白的一致性为50．81%。核定位信号、两个AP2保守结构域(及其之间区域)、miRNA172结合位点这三部分序列在不同物种间保守性较高，而其余序列在不同物种间保守性较低(图2)。核定位信号的同源性最高，所有植物的核定位信号序列均为KKSRRGPRSR。两个AP2结构域之间的序列同源性也非常高，说明这部分序列在连接两个结构域行使功能方面有重要作用。MiR172结合位点在比对的裸子植物(银杏)、单子叶植物(玉米)和被子植物 AP2序列中都存在，且保守性也很高。

图1 PmAP2基因CDS序列及推导的氨基酸序列

为进一步了解梅花与其他物种AP2蛋白的进化关系，利用MEGA6构建了梅花与其他17种植物AP2蛋白的系统进化树(图3)。根据系统进化树，18种植物的AP2蛋白可以分为3组。两种单子叶植物(小麦和玉米)单独聚为一组;3种裸子植物:银杏、黑松和欧洲云杉聚为一组;其余的双子叶植物的AP2蛋白为一组。在双子叶植物进化枝中，梅花与另外两种蔷薇科植物桃和苹果的亲缘关系最近，这3种植物的AP2蛋白先聚为一组，然后与其他双子叶植物的基因聚为一组。系统进化树与物种进化较为一致。

2．3 梅花AP2基因的表达模式

以梅花PP2A基因为内参，对PmAP2在不同组织(根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、外/中(果皮)、内果皮和种子)中的表达模式进行了研究。如图4a所示，PmAP2在梅花营养器官和生殖器官中均有表达，说明PmAP2广泛参与到梅花各种器官的发育。PmAP2在花瓣中表达量最高，其次为雌蕊和内果皮，而在营养器官(根、茎、叶)中的相对表达量较低，说明PmAP2在梅花生殖生长过程中发挥重要的作用。

梅花的花型非常丰富，但关于这些花型形成的机理尚缺乏相应的研究。鉴于AP2基因在花器官决定及花发育过程中有非常重要的作用，文中对PmAP2在单瓣、重瓣和台阁梅花中的表达模式进行了研究，以期为揭示梅花不同花型的形成机理奠定基础。如图4b所示，PmAP2在最原始的单瓣品种‘江梅’的表达量最低，而在花型最复杂的台阁品种‘素白台阁’的表达量最高，二者相差将近一倍(图4b)。其在重瓣品种‘三轮玉蝶’中的表达量居中。这表明随着花型复杂程度的增加，PmAP2的表达量呈上升的趋势，PmAP2可能参与了梅花复杂花型的形成。

3 结束语

本研究从梅花花蕾中成功分离出花器官决定基因PmAP2。序列同源性分析表明该基因与其他蔷薇科物种(桃和苹果)AP2基因的同源性非常高。该基因编码的蛋白具有AP2蛋白的典型特征:有两个高度保守的AP2结构域和一个完全保守的核定位信号［14］。这说明此基因属于AP2基因家族，且具有转录因子的特征。此外，蛋白序列同源性分析表明，除高度保守的两个AP2结构域(及其之间序列)、核定位信号和miR172靶位点这三部分序列外，不同物种的AP2基因保守性较低，说明AP2基因发生了种属特异的进化过程，从而导致不同物种AP2基因序列上的差异;而高度保守区域的存在说明这些区域在AP2正常功能发挥方面有着重要的作用，因而在进化过程中保存下来。例如，miR172靶位点在较原始的裸子植物(银杏)、单子叶植物和双子叶植物中都存在，说明miR172调控AP2表达是一种原始的调控机制，并且在维持AP2正常功能方面发挥着重要的作用，因而在长期的物种进化中保存了下来。

图2 梅花与其他物种AP2基因的多序列比对

图3 梅花与其他物种AP2系统进化树

图4 PmAP2表达模式

在花器官发育的ABC模型中，AP2基因行使A类基因的功能，参与了萼片和花瓣的决定。除此之外，两个A类基因(AP1和AP2)还参与了植物的成花转变和早期的花序分生组织建立［1，15－16］。在拟南芥和其他物种中，AP2在四轮花器官及营养生长组织中均有表达［6，13，17－19］。荧光定量PCR结果显示，PmAP2在梅花营养器官及四轮花器官中也均有表达，与前人研究结果基本一致［6，13，17－19］。花瓣的表达量最高，说明AP2在花瓣发育中发挥重要的作用。Jofuku et al．［6］研究表明，AP2基因在拟南芥种子发育尤其是种皮的发育中发挥重要作用。矮牵牛的三个AP2基因在成熟的胚乳中高表达，但在胚中不表达［20］。本研究发现PmAP2在梅花外果皮、中果皮(果肉)和内果皮的表达量都非常高，说明PmAP2还参与了梅花果实的发育，AP2基因对果实发育的调控机制在不同物种中是相似的。此外，文中还研究了PmAP2在不同花型梅花中的表达模式，结果表明，随着花型复杂程度的增加，PmAP2的表达量也在增加。这意味着AP2基因很可能参与了梅花复杂花型的形成。台阁花型是梅花中比较奇特的一类花型，是由于雌蕊被另外一朵花取代而形成的［21］。形态解剖表明，台阁的上位花是在原本应该分化雌蕊的位置分化出了萼片，进而分化出完整的上位花。由此推测，很可能是在原本应该C类基因表达的部位，A类基因特异表达，从而分化出上位花的萼片。因此，PmAP2在台阁花型梅花中的大量表达可能与台阁花上位花形成有关。

本研究克隆了梅花中的AP2基因，并对其表达模式进行了分析，为进一步研究梅花花发育的调控机理及花型形成与进化奠定了基础。

［1］Weigel D，Meyerowitz E M．The ABCs of floral homeotic genes［J］．Cell，1994，78(2):203－209．

［2］Coen E S，Meyerowitz E M．The war of the whorls:genetic interactions controlling flower development［J］．Nature，1991，353:31－37．

［3］TheiBen G，Saedler H．Plant biology:floral quartets［J］．Nature，2001，409:469－471．

［4］Causier B，Schwarz-Sommer Z，Davies B．Floral organ identity:20 years of ABCs［J］．Seminars in Cell＆Developmental Biology，2010，21(1):73－79．

［5］Okamuro J K，Caster B，Villarroel R，et al．The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94(13):7076－7081．

［6］Jofuku K D，Den Boer B G，Van Montagu M，et al．Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2［J］．The Plant Cell，1994，6(9):1211－1225．

［7］戴思兰．园林植物遗传学［M］．北京:中国林业出版社，2004．

［8］陈俊愉．中国梅花品种图志［M］．北京:中国林业出版社，2010．

［9］Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al．Clustal W and Clustal X version 2．0［J］．Bioinformatics，2007，23(21):2947－2948．

［10］Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al．MEGA6:Molecular evolutionary genetics analysis version 6．0［J］．Molecular Biology and Evolution，2013，30(12):2725－2729．

［11］Wang Tao，Hao Ruijie，Pan Huitang，et al．Selection of suitable reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction in Prunus mume during flowering stages and under different abiotic stress conditions［J］．Journal of the American Society for Horticultural Science，2014，139(2):113－122．

［12］Liu Zhaolei，Gu Chunsun，Chen Fadi，et al．Identification and expression of an APETALA2-Like gene from Nelumbo nucifera［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168(2):383－391．

［13］任磊，王雁，周琳，等．牡丹PsAP2基因的克隆及表达［J］．林业科学，2011，47(9):50－56．

［14］Kim S，Soltis P S，Wall K，et al．Phylogeny and domain evolution in the APETALA2-like gene Family［J］．Molecular Biology and Evolution，2006，23(1):107－120．

［15］Shannon S，Meeks-Wagner D R．Genetic Interactions that regulate inflorescence development in Arabidopsis［J］．The Plant Cell，1993，5(6):639－655．

［16］Kunst L，Klenz J E，Martinez-Zapater J，et al．AP2 gene determines the identity of perianth organs in flowers of Arabidopsis thaliana［J］．The Plant Cell，1989，1(12):1195－1208．

［17］宋长年，房经贵，王晨，等．基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析［J］．园艺学报，2009，36(6):799－806．

［18］宿红艳，周盛梅，王磊，等．草莓APETALA2同源基因的克隆及表达分析［J］．西北植物学报，2006，25(10):1937－1942．

［19］周盛梅，宿红艳，王磊，等．苹果apetala2同源基因的克隆和转化研究［J］．园艺学报，2006，33(2):239－243．

［20］Maes T，van de Steene N，Zethof J，et al．Petunia AP2-like genes and their role in flower and seed development［J］．The Plant Cell，2001，13(2):229－244．

［21］陈俊愉．中国梅花研究的几个方面［J］．北京林业大学学报，1995，17(S1):1－6．