不同储存时间血液制备洗涤红细胞效果分析

李美霖 段锦 麻静敏 车进 张燕华 李天君

洗涤红细胞经0.9%氯化钠溶液洗涤，去除了其中大部分血浆、白细胞和血小板［1］，可减少非溶血性发热反应(NHFTR)和血浆蛋白所致的过敏反应，减少或降低输血传播病毒的概率。虽然洗涤红细胞只能保留70%～80%的原红细胞，保存期较短，但临床贫血患者和紧急输血时均首选洗涤红细胞［2，3］，所以临床需求呈上升趋势。2012年7月卫生部发布的《全血及成分血质量要求》(GB18469-2012)［4］将洗涤红细胞质量控制项目中的“红细胞回收率”调整为“血红蛋白含量”，“血浆蛋白清除率”调整为“上清蛋白质含量”，并增加了对洗涤红细胞“溶血率”(≤0.8%)的要求。新国标仅规定使用保存期内的全血或悬浮红细胞制备洗涤红细胞，并未对原料血的储存时间进行规定。我们在对CPDA-1方全血制备的悬浮红细胞储存期内溶血率调查中发现悬浮红细胞溶血率随储存天数增加成进行性增加，储存期末溶血率指标不符合率为1.25%［5］。因此，为了监测以不同储存时间悬浮红细胞为原料制备的洗涤红细胞的质量，我们对不同保存时间的悬浮红细胞所制备的洗涤红细胞血红蛋白含量、上清蛋白质含量、血浆游离血红蛋白含量进行了检测，同时分析产品溶血情况，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 一次性使用塑料血袋(山东威高，批号:13070242)，四联袋0.9%氯化钠溶液(费森尤斯卡比，批号:85GG20AD004)，XS-500i血细胞计数仪(日本Sysmex公司)，M-300型半自动生化分析仪(Vital Scientific公司)，PC203型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，fresco离心机(SORVALL)，电热恒温水箱(北京市医疗设备厂)，血浆游离血红蛋白试剂盒(Trinder法)(北京瑞尔达公司，批号:150108);脑脊液与尿蛋白测定试剂盒(终点法)(北京利德曼公司，批号:402201L)，大容量离心机(Thermo公司)，无菌管路对接机(日本Terumo公司)，电子天平(美国双杰兄弟公司)。

1.2 方法

1.2.1 洗涤红细胞的制备:将随机采集400 ml CPDA-1保养液处方全血制备的2 U悬浮红细胞120袋保存于(4±2)℃储血专用冰箱，取储存期第7、14、21、28和35天的悬浮红细胞(无破损渗漏，血液外观正常)各24袋。待用洗涤溶液联袋提前放置冷凝保存，无破损渗漏，溶液外观正常，在有效期内。洗涤溶液联袋分别为1号，2号，3号，4号，把1号和2号的盐水全部挤入3号，4号，1号和2号排空待用。使用无菌接合机将待洗涤的红细胞悬液袋导管和洗涤溶液联袋进行无菌接合连通，将洗涤溶液移至红细胞袋内，液体量约为100 ml，夹紧导管，混匀后3 500 r/min离心［温度(4 ±2)℃］。离心后将血袋取出，避免震荡，垂直放入分浆夹中，把上清液转移至空袋内，将洗涤溶液再次移至红细胞袋内，液体量约为150 ml，夹紧导管。经上述步骤离心洗涤3次后加入适量 0.9%氯化钠溶液(50 ml/U)移入已完成洗涤的红细胞。将红细胞混匀后注满配血管，热合留取40 cm配血管进行检测。

1.3 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血红蛋白含量第28天与第35天、第7天与第35天比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。上清蛋白质含量第21天与第28天比较差异无统计学意义(P＞0.05)，其他各组两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。溶血率第7天与第14天比较溶血率差异无统计学意义(P＞0.05)，第7天、第14天与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，第21天、第28天和第35天两两比较差异无统计学意义(P＞0.05)，第35天组有一例洗涤红细胞的溶血率为0.85%，超出质量控制要求。原料血第7天与第14天比较溶血率差异无统计学意义(P＞0.05)，第7天、第14天与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同储存时间悬浮红细胞制备的洗涤红细胞检测结果 n=24，±s

表1 不同储存时间悬浮红细胞制备的洗涤红细胞检测结果 n=24，±s

注:与7 d比较，*P＜0.05;与14 d比较，#P＜0.05;与21 d比较，△P＜0.05;与28 d比较，☆P＜0.05

项目 第7天 第14天 第21天 第28天 第35天Hb含量(g) 43.98±5.81 43.72±9.19 39.86±11.89 42.43±4.26 39.55±3.49＊☆上清蛋白质含量(g) 0.36±0.12 0.46±0.20* 0.54±0.20*# 0.58±0.17*# 0.68±0.20*#△☆溶血率(%) 0.13±0.05 0.15±0.04 0.22±0.13*# 0.26±0.10*# 0.41±0.15*#原料血溶血率(%) 0.07±0.07 0.02±0.05* 0.13±0.08*# 0.27±0.11*#△ 0.48±0.19*#△☆

3 讨论

洗涤红细胞是采用特定的方法将保存期内的全血、悬浮红细胞用大量的等渗溶液进行洗涤，去除了几乎所有的血浆成分和部分非红细胞成分，并用氯化钠注射液或红细胞添加液悬浮所制成的红细胞成分血［4］。一般手工洗涤红细胞可以去除红细胞中90%左右的白细胞和99%以上的血浆蛋白。采用氯化钠注射液悬浮制备的洗涤红细胞可保存24 h，采用红细胞保养液悬浮制备的洗涤红细胞的保存期与普通红细胞相同。洗涤红细胞适用于输全血或血浆蛋白过敏而又需要继续输血，自身免疫溶血性贫血、高钾血症及肝、肾功能障碍需要输血、新生儿溶血病等患者。

血液保存在保养液中会发生红细胞保存损伤，保存15 d以后的全血制备的洗涤红细胞形态发生异常变化，出现棘形红细胞，囊泡化后的红细胞溶血，细胞寿命缩短影响洗涤红细胞的质量［7］。为避免留取的血样储存时间不同引起检测结果的差异，我们将检测时间均定为洗涤后1 h。表1显示随悬浮红细胞储存时间的延长，其制备的洗涤红细胞的溶血率呈上升趋势，其中第7天与第14天溶血率均值相近(P＞0.05)，该2组血液分别与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。其制备原料悬浮红细胞第7天与第14天比较溶血率差异无统计学意义(P＞0.05)，第7天、第14天与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。第35天组溶血率较第28天组上升明显，且有1例洗涤红细胞的溶血率为0.85%，超出新国标规定洗涤红细胞溶血率＜RBC总量的0.8%的要求。有研究显示，储存期末溶血率指标不符合率为1.1%［8］。FHb增加是血管内溶血的指标，FHb含量是红细胞制品质量控制的重要指标［9］，血液制品中过高的FHb可引起受血者急性肾功能衰竭等重副作用［10］。冯博等［11］的研究结果表明悬红储存时间对所制备的洗涤红细胞FHb影响较大，但对其制备的洗涤红细胞的K+影响较小，原因可能是制备洗涤红细胞的过程改变了红细胞的渗透压，导致红细胞的溶血增加。有报道［12］称手工制备洗涤红细胞的RBC回收率可达到89.29%，Hb在RBC内占有很大的比重，它的变化会直接影响红细胞的形态［1］，并影响溶血率。表1中除第28天与第35天、第7天与第35天的血红蛋白含量比较差异有统计学意义(P＜0.05)外，其余各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。由此可见，应用0.9%氯化钠溶液对悬浮红细胞进行洗涤并未对Hb含量产生较明显的影响。洗涤红细胞的制备过程中因为献血者个体差异、洗涤的方法和步骤不同、制备人员的操作差异等均可能对洗涤红细胞的溶血率产生影响。本实验测定上清蛋白质浓度使用的终点法即邻苯三酚红钼络合显色法，数据显示洗涤红细胞的上清蛋白质含量随其原料悬浮红细胞的储存时间延长而逐渐递增，但均在新国标要求范围内(＜1.0 g)。除第21天与第28天比较差异无统计学意义(P＜0.05)，其他各组两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。如果采用双缩脲法测定上清液蛋白，只有非常灵敏的仪器方可达到要求［6］，因此应用邻苯三酚红钼络合显色法可检测到上清液中的微量蛋白，结果更加准确可靠。

洗涤红细胞制备过程中会丢失部分红细胞［13］，王爱梅等［7］经过对不同保存期血液制备成洗涤红细胞的超微结构变化，采用扫描电子显微镜观察研究认为，4℃保存10 d内的全血最佳。因为10 d内的红细胞形态具有完整的结构和正常的生理功能，细胞膜能承受一定的离心压力，输注后能提高红细胞的活力［7］。另有研究表明红细胞随储存时间的延长其携氧能力不断下降，库存前2周其携氧能力下降的尤为明显，贮存35 d的红细胞携氧能力仅为0 d的50%［14］。本研究显示洗涤红细胞的上清蛋白质含量和溶血率随其制备原料悬浮红细胞储存时间的延长而增加，与上述研究的结果一致。因此，使用储存期较长的悬浮红细胞制成的洗涤红细胞溶血率可能会超出国家标准。

洗涤红细胞制品成为临床常用的血液用品，在非溶血性发热反应和血浆蛋白所致的过敏反应应用中起着不可替代的作用。目前广泛应用的CPDA保养液对ATP的保存效果明显优于ACD和CPD保养液。红细胞输入患者体内24 h后，其存活率一般要求大于75%。红细胞保存过程中重要的变化就是红细胞中ATP水平降低。在CPDA保养液中，腺嘌呤可先合成AMP，进一步磷酸化生成ATP，可有效促进红细胞代谢［15］。我们在对CPDA-1方全血制备的悬浮红细胞和去白细胞悬浮红细胞储存期内溶血率的调查中发现，2组红细胞均采用CPDA-1保养液，悬浮红细胞组溶血率优于ACD-B保养液采集的悬浮红细胞［5］，这与一些研究的结果［16］是一致的。《血站技术操作规程》(2012版)中提出通过导管接驳技术制备的洗涤红细胞，并且以红细胞保存液混悬，可以延长洗涤红细胞保存期。添加MAP红细胞保存液延长了洗涤红细胞的保存期，使其更加广泛的应用于临床。

综上所述，悬浮红细胞储存时间对制备的洗涤红细胞质量有较大影响，洗涤红细胞的上清蛋白质含量和溶血率随其制备原料悬浮红细胞储存时间的延长而增加。14 d内的悬浮红细胞制备的洗涤红细胞的上清蛋白质含量和溶血率均较低，使用保存期较长的悬浮红细胞制备的洗涤红细胞产品溶血率可能会超出国家标准。因此，建议血站尽量选择储存期在14 d内的悬浮红细胞用于制备洗涤红细胞，以避免使用储存期末悬浮红细胞制备洗涤红细胞而导致临床输注效果下降。另外，在添加MAP红细胞保存液的洗涤红细胞也尽量缩短保存期，以减少一些特殊患者如高钾血症患者的副作用［17］。

1 杨成民，李家增，季阳主编.基础输血学.第1版.北京:中国科学技术出版社，2001.668.

2 德玉林.洗涤红细胞的内科临床应用.职业与健康，2007，23:1357-1358.

3 张艳华，李广庆，陈兰兰，等.制备洗涤红细胞方法关键控制点改进体会.河北医药，2011，33:622-623.

4 GB18469-2012.全血及成分血质量要求.

5 李美霖，车进，张燕华，等.CPDA-1方全血制备的悬浮红细胞和去白细胞悬浮红细胞储存期内溶血率的调查.实用医学杂志，2014，30: 3034-3035.

6 中华人民共和国卫生部主编.全国临床检验操作规程.第1版.南京:东南大学出版社，2006.342-344.

7 王爱梅，梁文华，王群，等.不同保存期全血制备洗涤红细胞的超微结构变化.临床输血与检验，2004，6:173-176.

8 陈冬梅，任芙蓉，龚晓燕，等.全血、悬浮红细胞和去白细胞悬浮红细胞储存期末溶血率调查.北京医学，2012，34:773-775.

9 罗圆圆，桂萍，潘继春，等.滤除白细胞对悬浮红细胞不同贮存期溶血率的影响.中国输血杂志，2013，26:728-729.

10 Natanson C，Kern SJ，Lurie P，et al.Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial infarctionand death:a meta-analysis. JAMA，2008，299:2304-2312.

11 冯博，段澜，王景文，等.悬浮红细胞储存时间对制备的洗涤红细胞钾离子和游离血红蛋白含量的影响.中国输血杂志，2012，25:834-836.

12 周俊，吴涛，姜瑞民，等.悬浮红细胞制备洗涤红细胞不同方式的比较分析.中国输血杂志，2013，26:887-888.

13 沈莉，李建民，梁晓虎，等.提高洗涤红细胞制品质量的探讨.河北医药，2006，28:710-711.

14 张婷，潘纪春，庄远，等.不同保存时间的库存红细胞携氧能力变化研究.中国输血杂志，2013，26:434-438.

15 唐会珍，陈海珊，张献清.红细胞保存损伤及其对策.临床输血与检验，2013，15:187-190.

16 龚裕春，邱颖婕，金魏名，等.去白细胞悬浮红细胞与悬浮红细胞储存期内溶血率的比较.中国输血杂志，2013，26:151-152.

17 冯博，段澜，任芙蓉，等.用于高钾血症贫血患者的洗涤红细胞可保存时间的研究.中国输血杂志，2014，28:123-125.