复配抑菌剂对两种腐败菌抑制效果评价

潘晓倩，张顺亮，乔晓玲，陈文华，曲 超，艾 婷，王守伟

(中国肉类食品综合研究中心，北京 100068)

肉制品在贮藏和运输过程中易腐败变质，其中微生物生长繁殖是主要原因［1，2］，因此如何控制微生物的生长是延长肉制品货架期的重要手段之一。其中，高温杀菌技术能够彻底杀灭微生物保证产品的常温流通，但肉制品营养风味损失较大，不能满足人们对高品质肉制品的需求，所以，迫切需要开发新型肉类产品形式，能够同时满足人们对肉制品高品质和常温下长保质期的需要。添加防腐抑菌剂是肉制品腐败微生物控制技术的重要方法之一，可分为化学抑菌剂和天然抑菌剂两大类。化学抑菌剂在肉制品中应用已有较长的历史，主要是有机酸及其盐类，包括乳酸钠、双乙酸钠、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、亚硝酸钠等，它们具有良好的抑菌作用，也有一定的毒性，因此我国严格规定了其在食品中的使用限量［3-6］。葡萄糖酸-δ-内酯是一种多功能、低毒性的食品添加剂，近年来在肉制品保鲜领域得到一定开发和应用［7，8］。以乳酸链球菌素(Nisin)为代表的天然生物抑菌剂以其安全无毒副作用的特点受到人们的青睐，但由于稳定性、价格等多种因素仍无法完全取代化学抑菌剂［9-11］，因此，研究开发新型的复合防腐保鲜剂既能提高抑菌剂的安全性又不失其抑菌效果。本试验拟采用酶标比浊法测定7 种食品抑菌剂对大肠杆菌(G-杆菌)和金黄色葡萄球菌(G+球菌)2 种腐败菌的抑制效果，采用L16(45)正交试验设计确定各因素水平的最佳配比，旨在为安全复配型抑菌剂在肉制品中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，中国肉类食品综合研究中心检测中心实验室保藏。

主要试剂:乳酸钠、乳酸链球菌素(Nisin)、亚硝酸钠(北京迪朗生化科技有限公司);双乙酸钠(连云港信仁食品添加剂有限公司;山梨酸钾(宁波王龙科技股份有限公司);脱氢乙酸钠(南通奥凯生物技术开发有限公司);葡萄糖酸-δ-内酯(安徽省兴宙医药食品有限公司);NaOH、盐酸、乙醇、NaCl (分析纯，北京化学试剂厂);培养基、平板计数琼脂、营养肉汤(北京陆桥技术有限责任公司)。

1.2 仪器与设备

Synergy H4 型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);PB-10 型数显酸度计(赛多利斯科学仪器有限公司);SL502N 型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司;生物安全柜)新加坡Esco 公司;F1-45 型恒温培养箱、G154DWS 湿热灭菌锅(日本三洋公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制备

无菌条件下，将甘油保藏的菌种连续活化2 次。取活化后的新鲜菌液离心弃去营养肉汤，再用无菌营养肉汤将其稀释至104CFU/mL 备用。

1.3.2 单一抑菌剂对两种腐败菌生长的影响

取活化后菌液浓度为104CFU/mL 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液，接种于营养肉汤中得到3.01g (CFU/g)菌液，根据《食品添加剂使用标准》中对于不同防腐剂的使用限量要求，分别加入不同浓度梯度的各抑菌剂，使抑菌剂终浓度范围为:双乙酸钠(0～3.0g/L)、乳酸钠(0～2.5g/L)、Nisin (0～0.5g/L)、山梨酸钾(0～0.075g/L)、脱氢乙酸钠(0～0.5g/L)、亚硝酸钠(0～0.15g/L)、葡 萄糖酸-δ-内酯 (0～2.0g/L)，在30℃培养48h 后测定菌液OD600，每一组做3 个平行;以添加生理盐水作为对照组。抑菌率计算公式为:

1.3.3 抑菌剂复合使用正交试验

根据单因素试验的结果，并结合实际生产经验，以双乙酸钠、乳酸钠、Nisin、山梨酸钾和葡萄糖酸-δ-内酯为因素，采用L16(45)正交试验，以牛津杯法测定其抑菌活性大小，每组3 个平行，无菌生理盐水作为空白对照。正交试验的因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平 单位:g/L

2 结果与分析

2.1 单一抑菌剂的抑制效果

根据《食品添加剂使用标准》中对于不同抑菌剂使用的限量要求，7 种抑菌剂选取从低到高5 个浓度梯度，各自的浓度变化范围见表2。

表2 7 种抑菌剂的浓度 单位:g/L

7 种抑菌剂在各自的浓度变化范围内对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用如图1 和图2 所示。由图1可知，除Nisin 对大肠杆菌没有表现出抑菌作用外，其余6 种抑菌剂对大肠杆菌均有一定的抑菌效果，其中对大肠杆菌具有良好抑菌效果(最高抑菌率≥50%)的抑菌剂有双乙酸钠、乳酸钠、山梨酸钾和葡萄糖酸-δ-内酯。由图2 可知，对金黄色葡萄球菌具有良好抑菌效果(抑菌率≥50%)的抑菌剂有双乙酸钠、脱氢醋酸钠、乳酸钠、Nisin 和葡萄糖酸-δ-内酯。

图1 7 种抑菌剂对大肠杆菌的抑制效果

图2 7 种抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果

双乙酸钠在生物体内最终代谢产物是水、钠和二氧化碳，被公认为是较为安全的抑菌剂，其抑菌作用主要是由于双乙酸钠在自然状态下释放出乙酸，渗透到细胞中，干扰细胞间酶的相互作用，可使细胞内的蛋白质变性，从而起到抗菌的作用［12］。脱氢醋酸钠是一种广谱型抑菌剂，其最大特点是在酸性或偏碱性条件下仍然有效且受热不被破坏，对肌体无害［13］。脱氢醋酸钠对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率随质量浓度的增加而逐渐提高，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更加显著。乳酸钠是由乳酸制备得到的衍生物，可直接用于食品作为乳化剂、风味强化剂、保湿剂和pH 值调节剂，被美国食品与药品管理局批准为“公认为安全物质(GRAS)”，但目前，乳酸钠的抑菌机理尚未明确。山梨酸钾能够很好地抑制大肠杆菌，但对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，这也与之前的研究结果部分相符［14，15］。可见，山梨酸钾的抑菌作用具有一定的局限性，不宜单独在肉制品中使用。亚硝酸钠是一种肉用腌制剂，除具有发色作用外还有一定的防腐效果，如图1、2 所示，亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更好。长期食用含有硝酸盐的食品可引起癌症、甲状腺肿大等4 种病症，因此我国严格规定了其在食品中的添加量，目前，关于替代亚硝酸盐的新型食品抑菌剂，发色剂等产品的研究具有广阔的应用前景。Nisin 是某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。研究表明，Nisin能抑制大部分革兰氏阳性菌(G+菌)及其芽孢的生长繁殖，但对革兰氏阴性菌(G-菌)、酵母菌和霉菌没有明显作用［16-18］，这也与本试验的结果相一致。葡萄糖酸-δ-内酯是一种新型无毒的多功能的食品添加剂，其防腐保鲜作用表现在溶于水后，迅速分解并释放出酸性物质—葡萄糖酸。如图1、2 所示，葡萄糖酸-δ-内酯对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都能发挥很好的抑制作用，在浓度为2.0g/L 时，对2 种菌的抑菌率分别达到99.73%和87.86%。可见，葡萄糖酸-δ-内酯作为新型防腐保鲜剂有着非常广阔的应用前景。

2.2 正交试验结果

不同抑菌剂机理不同，作用于微生物上的靶点也不同，由于肉制品中微生物体系较为复杂，将几种抑菌剂混合使用效果更好。复配时各抑菌剂浓度的选择参照单因素试验结果，并且符合(其中A1、B1 表示复配抑菌剂中某一种抑菌剂的浓度;A、B 表示对应的该抑菌剂的最高限量浓度)。每个因素水平下的抑菌结果见表2。

由正交试验极差分析可以看出，各因素影响对大肠杆菌的抑制效果的主次顺序为:双乙酸钠＞葡萄糖酸-δ-内酯＞乳酸钠＞山梨酸钾＞Nisin，各因素水平最佳组合为A3B3C1D2E4，即双乙酸钠0.9g/L、乳酸钠1.5g/L、Nisin 0.05g/L、山梨酸钾0.020g/L、葡萄糖酸-δ-内酯2.0g/L。各因素影响对金黄色葡萄球菌的抑制效果的主次顺序为:乳酸钠＞葡萄糖酸-δ-内酯＞双乙酸钠＞Nisin ＞山梨酸钾，各因素水平最佳组合为A3B4C2D1E3，即双乙酸钠0.9g/L、乳酸钠2.0g/L、Nisin 0.1g/L、山梨酸钾0.015g/L、葡萄糖酸-δ-内酯1.5g/L。每种抑菌剂的抑菌范围有限，且某些抑菌剂的活性和稳定性易受到加工环境影响，多种抑菌剂复配使用往往能发挥其协同增效作用，更好地延长肉制品货架期。如乳酸钠、双乙酸钠在发挥抑菌作用的同时提供酸性环境，从而提高了Nisin 的抑菌活性。研究发现［19，20］，乳酸钠与双乙酸钠、乳酸钠与Nisin、山梨酸钾与Nisin 之间存在明显的协同作用。

表2 正交试验结果及极差分析

3 结论

双乙酸钠0.9g/L、乳酸钠2.0g/L、Nisin 0.1g/L、山梨酸钾0.015g/L、葡萄糖酸-δ-内酯1.5g/L。

G+菌和G-菌细胞壁结构显著不同，导致这两类细菌对药物的敏感性差异较大［21］。本试验结果也证明了大肠杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)对多数抑菌剂的敏感性存在一定差异。本试验中，对大肠杆菌抑制效果最好的抑菌剂组合为:双乙酸钠0.9g/L、乳酸钠1.5g/L、Nisin 0.05g/L、山梨酸钾0.020g/L、葡萄糖酸-δ-内酯2.0g/L。对金黄色葡萄球菌抑制效果最好的抑菌剂组合为

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