甘灵茶抗氧化成分的提取工艺研究

2015-03-06邵素娟段振华

中国食物与营养 2015年11期

万鹏，颜颢，邵素娟，段振华

(海南大学食品学院，海口 570228)

灵芝(Ganoderma lucidum)外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。我国最早的药学专著《神农本草经》将灵芝列为上品，有紫、赤、青、黄、白、黑六种，被称之为:“上上之药，方中妙品”［1］。灵芝多糖GLA、GLB、GLC 对超氧阴离子自由基(O－2 ·)的产生和红细胞脂质过氧化均有抑制作用，并对羟基自由基(·OH)有清除作用，具有超氧化物歧化酶样活性，是灵芝抗氧化、延缓衰老的重要因素［2-4］。

甘灵茶的原料来自于甘草和灵芝，接种过灵芝的甘草布满了灵芝菌丝体，通过灵芝菌丝的分解，将甘草里难以被人吸收的物质转化成易被人体吸收的成分，因而营养、保健与药用价值得到了更大的提高。本文以甘灵茶为原料，从中提取抗氧化成分，以甘灵茶提取液清除DPPH 的效果为评价指标，研究甘灵茶中抗氧化成分的提取技术，并对提取液中的多酚和多糖进行测定，旨在为甘灵茶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘灵茶，海南全仙禾生物科技有限公司提供;96%DPPH，上海源叶生物科技有限公司;95%乙醇、氢氧化钠、盐酸、福林酚、碳酸钠、无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸均为国产分析纯。

1.2 仪器及设备

EL204 型电子天平，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;A11BS 型高速组织捣碎机，IKA 集团;HHS26S 型电热恒温水浴锅，江苏金坛市大地自动化仪器厂;PHS-3C 型pH 计，上海精密科学仪器有限公司;722 可见分光光度计，上海奥普勒有限公司;101-2 型电热鼓风恒温干燥箱，常州市华普达教学仪器有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 蒽酮试剂的配制精确称取蒽酮2.000g，用98%浓硫酸溶解并定容至1 000mL。

1.3.2 DNS 试剂的配制精确称取6.5g 3，5-二硝基水杨酸溶于少量热水，移入1000mL 容量瓶，加入2moL/L 氢氧化钠溶液325mL，再加入丙三醇45g，摇匀，定容至1000mL。

1.4 DPPH 清除率的测定方法［5-6］

称取DPPH 试剂7.9mg，用乙醇溶液溶解，定量转入100mL 容量瓶中，并定容至刻度，摇匀得浓度为79.0mg/L DPPH 储备液(2.0×10－4mol/L)置于冰箱中冷藏备用。利用DPPH 自由基的溶液特征紫红色团的吸收峰，用分光光度法分别测定各样品提取液在波长517nm 处吸收值。按表1 加反应液。

表1 试样加样表

将Ai所表示的样品溶液在室温下避光反应一定时间(30min)后，在517nm 处，以调零管为基准，先测定每个条件下空白对照组的吸收值(A0)，再平行测定该条件下三次吸收值(Ai)，求得清除率的平均值。DPPH 清除率的计算公式为(1)式:

DPPH 清除率(%)=1－Ai/A0×100 (1)

1.5 多酚的测定方法［7］

标准曲线的测定;采用福林—酚法。精密称取20mg 没食子酸标准品，蒸馏水溶解并定容至200mL 分别吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL 标准品溶液，各补水至0.5mL。然后加入10%FC 试剂2.5mL，充分摇匀。反应5min 后加入溶液7.5%Na2CO3溶液5mL，50℃水浴锅中反应5min。室温避光保存1h。于波长760nm 处测定吸光度。标准曲线回归方程结果为:Y=5.398 6X+0.020 2，R2=0.995 4，Y:吸光度;X:没食子酸质量浓度(mg/mL)。

样品测定;吸取甘灵茶提取液0.5mL，按上述步骤操作测定吸光度，以标准曲线回归方程和用量计算甘灵茶提取液多酚得率见(2)式。

1.6 多糖的测定方法［8］

1.6.1 总糖标准曲线的制作

采用蒽酮—硫酸法。精确量取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 葡萄糖标准液(100mg/mL)于6 支试管中，再分别加入蒸馏水至总体积为1mL，摇匀后分别加入5mL 蒽酮试剂，混匀后置于沸水浴中加热6min，取出冷却至室温，以空白管为对照，在620nm 波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为:y=192.56x-0.386 7，R2=0.999 9。

样品测定:吸取甘灵茶提取液1mL，按上述步骤操作测定吸光度，以线性回归方程和用量计算甘灵茶提取液总糖含量。

1.6.2 还原糖标准曲线的制作

采用DNS 法。分别精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 葡萄糖标准液(1 000mg/L)，加入8 个25mL 容量瓶中，加水至总体积为2.5mL，再分别加入3mL DNS 试剂，混匀后置于沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，加水定容至25mL，摇匀后，以空白管为对照，在540nm 处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为:y=4326.2x +101.01，R2=0.999 7。

样品测定:吸取甘灵茶提取液2.5mL，按上述步骤操作测定吸光度，以线性回归方程和用量计算甘灵茶提取液还原糖含量。

1.6.3 多糖含量计算

多糖含量=总糖含量－还原糖含量

1.7 试验方法

1.7.1 单因素试验

(1)提取温度的确定:在蒸馏水pH 为7.0、提取时间为15min、甘灵茶用量为3%的情况下，提取温度分别为40、50、60、70、80℃条件下，以提取液清除DPPH 的能力为指标，确定最佳提取温度。

(2)pH 的确定:在提取温度为60℃，提取时间为15min、甘灵茶用量为3%的情况下，溶剂(蒸馏水)pH 分别为2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 的条件下，以提取液清除DPPH 的能力为指标，确定最佳pH。

(3)提取时间的确定:在提取温度为60℃、蒸馏水的pH 为6.5、甘灵茶用量为3%的情况下，提取时间分别为5、15、25、35、45、55min，以提取液清除DPPH 的能力为指标，确定最佳提取时间。

(4)甘灵茶用量的确定:在提取温度为60℃、蒸馏水的pH 为6.5、提取时间为15min 的情况下，甘灵茶用量分别为1%、2%、3%、4%、5%时，以提取液清除DPPH 的能力为指标，确定最佳用量。

1.7.2 测定甘灵茶提取液DPPH 清除率［9］

在单因素试验的基础上，以提取温度、溶剂pH、提取时间、甘灵茶用量为因素，DPPH 清除率为指标，设计了四因素三水平的正交试验，各因素水平见表2。

表2 正交试验设计

2 结果与讨论

2.1 温度对甘灵茶提取液的抗氧化性影响

在蒸馏水pH 为7.0、提取时间为15min、甘灵茶用量为3%的情况下，分别测定40、50、60、70、80℃等5 个不同温度条件下的甘灵茶提取液的DPPH 清除率，结果见图1。

从图1 可知，随着温度的升高，DPPH 清除率呈现先上升后下降然后趋于平稳的变化趋势。温度在50～60℃的范围内，曲线的斜率最大，即DPPH 清除率值增加最快，当温度高于60℃时，曲线下降后趋于平稳。因而提取温度以60℃最佳。原因可能是随着温度的升高，抗氧化物质如多酚和多糖等渗出、扩散速率加快，从而DPPH 清除率升高，但温度高于60℃，DPPH 清除率反而下降，这是由高温对抗氧化物质活性不利。

图1 不同提取温度对甘灵茶提取液DPPH 清除率的影响

2.2 溶剂pH 值对甘灵茶提取液的抗氧化性影响

在提取温度为60℃、提取时间为15min、甘灵茶用量为3%的情况下，测定了pH 分别为2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 时甘灵茶提取液的DPPH 清除率。由图2 可知，随着pH 的升高，曲线开始相差不大，随后呈先升后降的趋势，当pH 为6.5 时，甘灵茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是是pH 过高或过低都会影响甘灵茶抗氧化物质的活性，因而取pH 为6.5 最适宜。

图2 不同提取pH 值对甘灵茶提取液DPPH 清除率的影响

2.3 提取时间对甘灵茶提取液的抗氧化性影响

在提取温度为60℃、蒸馏水的pH 为6.5、甘灵茶用量为3%的情况下，测出提取时间分别为5、15、25、35、45、55min 的条件下对甘灵茶提取液的DPPH 清除率的影响，结果见图3。

图3 不同提取时间对甘灵茶提取液DPPH 清除率的影响

由图3 可知，随着提取时间的增加，曲线呈先升后降的趋势，当提取时间为15min 时，甘灵茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是时间过长多酚类等活性物质的结构发生改变，如由于多酚类羟基的氧化、偶联作用，多酚羟基数量减少，抗氧化能力相应降低［10］，导致DPPH 清除率下降。

2.4 甘灵茶用量对甘灵茶提取液的抗氧化性影响

在提取温度为60℃、蒸馏水的PH 为6.5、提取温度为60℃的情况下，测出甘灵茶用量分别为1%、2%、3%、4%、5%时甘灵茶提取液的DPPH 清除率，结果见图4。

由图4 可知，随着甘灵茶用量的增加，曲线呈先升后降的趋势，当甘灵茶的用量为3%时，甘灵茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是随着甘灵茶用量的增加，抗氧化活性物质的溶出、扩散速率加快，从而促进提取液中多酚、多糖等成分的提高，因此DPPH 清除率升高。当甘灵茶用量继续增加时，在同样的提取时间下用量大的甘灵茶浸泡不够彻底，不利于原料中多酚、多糖的溶出，使DPPH 清除率下降。因此，甘灵茶用量取3%最佳。

图4 不同甘灵茶用量对甘灵茶提取液DPPH 清除率的影响

2.5 甘灵茶提取液的正交试验

根据上述单因素试验结果，对提取温度，提取pH，提取时间，甘灵茶用量进行了正交试验，试验结果及方差分析结果分别见表3 和表4。可以看出各因素对甘灵茶提取液影响顺序为B ＞D ＞A ＞C，即提取pH 的影响最大，甘灵茶用量其次，提取温度次之，提取时间的影响最小。从正交试验结果看，提取温度应选水平3 较好，提取时间选水平3 较好。但是方差分析结果表明只有提取pH 和甘灵茶用量2 个因素的影响显著，加上节能和提取速率的考虑，决定提取温度选水平2、提取时间选水平1 较好。综上，最佳提取工艺为A2B3C1D2。即pH 为8.5、甘灵茶用量为3%、温度60℃、时间15min，在此条件下DPPH 清除率为86.24%。

多酚具有较强的清除自由基、抗氧化活性［7，11］。最近的研究表明，灵芝多糖对细胞的抗氧化作用十分明显［12］。为此，对提取液中的多酚和多糖分别进行了测定，发现多酚含量为0.187mg/mL，多糖含量为0.244mg/mL。因此，这些成分对DPPH 清除率的提高起着重要的作用。