蟛蜞菊内酯大鼠血浆蛋白结合率的测定

方 悦，黄学娟，尤心怡，尹智勇，张朝凤，张 勉

中国药科大学 中药学院生药学研究室，南京 210009

蟛蜞菊内酯大鼠血浆蛋白结合率的测定

方 悦，黄学娟，尤心怡，尹智勇，张朝凤*，张 勉

中国药科大学 中药学院生药学研究室，南京 210009

目的：测定蟛蜞菊内酯与大鼠血浆蛋白的结合率。方法：采用平衡透析法模拟蟛蜞菊内酯与大鼠血浆蛋白的结合过程，建立HPLC-UV法测定蟛蜞菊内酯与大鼠血浆蛋白的结合率。结果：在透析24 h后，蟛蜞菊内酯在低（0.62 μg·mL-1）、中（3.10 μg·mL-1）、高（9.92 μg·mL-1）3个质量浓度下与大鼠血浆蛋白的结合率分别为（87.9±2.1）%、（84.7±2.5）%、（83.8±1.9）%。结论：蟛蜞菊内酯与大鼠血浆蛋白有较强的结合作用。

蟛蜞菊内酯；血浆蛋白结合率；平衡透析法；高效液相色谱法

蟛蜞菊内酯（wedelolactone，WEL，见图1）为中药材墨旱莲Herba Ecliptae中分离得到的一种香豆草醚类小分子活性物质（分子式C16H10O7）。本课题组前期研究将其作为指标性成分制定了中药材墨旱莲的质量标准，并收载于2010版《中国药典》[1]。近年来，多项药理研究表明WEL作为Na+-K+-ATP酶及异构酶Ⅱ型的抑制剂[2-3]，发挥着保肝、抗经后骨质疏松、免疫抑制、抗癌等作用，应用前景十分广阔，然而其药动学研究却未见报道。药物血浆蛋白结合率（binding rate of plasma protein，BRPP）是药动学的重要参数之一，它直接影响药物的作用强度和半衰期，对药物临床应用具有重要的指导意义。本文通过建立HPLC法测定WEL在大鼠血浆和透析液中的含量，结合平衡透析法考察WEL与大鼠血浆蛋白的结合率，为其进一步开发利用提供依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

WEL（自制，经TLC、HPLC鉴定为WEL，纯度≥98%）；滨蒿内酯（scoparone，上海源叶生物科技有限公司，批号：20120627，纯度≥98%）；乙腈；甲酸为色谱纯；其余试剂为分析纯；水（纯净水）。

1.2 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪 （Agilent公司，含G1312A二元泵，G1313A自动进样器，G1314A紫外检测器，G1316A柱温箱）；AL104万分之一电子天平（上海市梅特勒-托利多仪器有限公司）；MD44透析袋（南京纳晟生物公司，截留分子量为8000-14000）。

1.3 动物

雄性SD大鼠，体重（200±20）g，购于扬州大学比较医学中心，实验动物许可证号SCXK（苏）2012-0004。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent公司）；C18预柱 （4.6 mm×7.5 mm，5 μm，Alltech）；流动相：乙腈-0.25%甲酸（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25℃；进样量：20 μL；检测波长：351 nm（选择WEL的最大吸收波长，见图2）。

2.2 溶液的配制

空白透析液：精密称取K2HPO414.11 g、KH2PO42.59 g、NaCl 1.99 g，加蒸馏水溶解并稀释至1 L，即空白透析液。调节pH值至7.4，置4℃冰箱中保存备用。

WEL储备液及系列标准溶液：精密称取WEL对照品12．4 mg，置于10 mL量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1240 μg·mL-1储备液。精密量取储备液适量，分别置于10 mL量瓶中，乙腈稀释至刻度，摇匀，制成124、62、31、15．5、7．75、3．875、1．9375μg·mL-1系列标准溶液。置4℃冰箱保存备用。

内标溶液：精密称取滨蒿内酯标准品6．4 mg置于10 mL量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得640 μg·mL-1的内标储备液。精密量取该储备液1 mL置于10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得64．0 μg·mL-1的内标溶液。置4℃冰箱保存备用。

2.3 透析液样品的处理

取血浆（透析内液）样品100 μL，置于1．5 mL离心管中，加入内标溶液10 μL，涡旋混合30 s，加入乙腈200 μL，涡旋混合1 min，以1．2×104r·min-1离心10 min，吸取上清液200 μL转移至另一1．5 mL离心管中，于37℃空气流下吹干。残渣加流动相100μL超声处理30s，涡旋混合1min，再以1．2×104r· min-1离心10 min，吸取上清液20 μL进样。

取含药透析液（透析外液）样品，过滤（0．45 μm滤膜），吸取100 μL置于1．5 mL离心管中，加入内标溶液10 μL，涡旋混合30 s，于37℃空气流下吹干。残渣加流动相100 μL，超声处理30 s，涡旋混合1 min，吸取上清液20 μL进样。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察 在“2．1”项色谱条件下，内标物和WEL的保留时间分别是9．9 min和12．8 min，内源性物质对测定没有干扰（见图3）。

2.4.2 线性关系 精密量取大鼠空白血浆和透析液各90 μL，加入WEL标准溶液10 μL，分别制成浓度为12．4、6．2、3．1、1．55、0．78、0．39 μg·mL-1透析内液及浓度为12．4、6．2、3．1、1．55、0．78、0．39、0．19 μg· mL-1透析外液。按照“2．3”项方法处理各样品，每一浓度进行双样本分析。记录色谱图和峰面积，以WEL浓度（c，μg·mL-1）为横坐标，WEL和内标物的峰面积比为纵坐标（A），进行线性回归。透析内液的回归方程为A1=0．2410c+0．0546，r2=0．9992。透析外液的回归方程A2=0．2543c-0．1226，r2=0．9989。结果表明，透析内液中WEL在0．39～12．4 μg·mL-1范围内线性关系良好，该方法的定量下限为0．39 μg·mL-1。透析外液中WEL在0．19～12．4 μg·mL-1范围内线性关系良好，该方法的定量下限为0．19 μg·mL-1。

2.4.3 精密度和准确度试验 按照“2．3”项方法分别制备WEL的3个不同浓度（0．62、3．10、9．92 μg·mL-1）的血浆样品和3个不同浓度（0．35、3．10、9．92μg·mL-1）的透析外液样品，每个浓度5样本，连续测定3天，考察其日内和日间精密度（RSD）及准确度（RE）。结果表明，该方法符合生物样品的分析方法（见表1）。

图3 蟛蜞菊内酯与滨蒿内酯在大鼠血浆和透析液中的HPLC图谱

表1 不同浓度的蟛蜞菊内酯在大鼠血浆和透析液中的准确度和精密度及提取回收率（n=5）

2.4.4 提取回收率试验 同法制备WEL血浆及透析外液的样品，以提取后的色谱峰面积与未经提取直接进样获得的色谱峰面积之比考察样品的提取回收率。结果表明，WEL在血浆和透析外液中的提取回收率均大于90%（见表1），内标物在血浆和透析外液中的提取回收率分别为 92．1%±8．1%和97．2%±6．1%，该提取方法回收率高且稳定。

2.4.5 稳定性考察 同法制备WEL在血浆及透析外液中的样品，考察各样品在4℃放置48 h和-20℃冻存20 d的稳定性。结果表明稳定性良好。

2.5 WEL血浆蛋白结合率的测定

2.5.1 平衡透析方法 将预处理后的透析袋一端折叠，扎紧，去除袋内水分，精密加入空白血浆200 μL，袋内留有一小段气泡，排出多余空气。折叠透析袋另一端，用棉线扎紧。将其悬浮于20 mL含有不同浓度WEL的含药透析液中，使透析袋内外液面保持同一高度，加盖密闭后于4℃冰箱放置平衡。透析结束后，用体积分数为10%高氯酸溶液检查透析外液有无蛋白漏出。取出透析袋，精密吸取一定量的血浆样本和袋外透析液，分别测定透析袋内血浆药物浓度（即总质量浓度c1）和透析外液中药物浓度（即游离药物浓度c2），计算药物的血浆蛋白结合率[4]。血浆蛋白结合率=（c1-c2）/c1×100%。

2.5.2 透析膜对药物的吸附作用 在透析袋内加入空白透析液2 mL（设体积为V1），将其置于盛有20 mL（设体积为V2）WEL浓度为ρ1的透析液中，4℃放置24 h，测定透析袋外的WEL浓度ρ2，透析袋对药物的吸附率X用下式[5]计算：

结果为透析袋对WEL有微量吸附，对不同浓度（0．62、3．10、9．92 μg·mL-1）的吸附率分别为0．96% ±0．61%，1．13%±0．55%及1．05%±0．38%。但该吸附作用对测定WEL的血浆蛋白结合率没有明显影响。

2.5.3 平衡时间的考察 配制3种不同浓度WEL含药透析液，置4℃冰箱分别平衡8、12、24、48 h。每个浓度5样本，同法计算血浆蛋白结合率（见表2）。组间方差分析显示，24 h和48 h蛋白结合率的差异没有统计学意义（P＞0．05），确定经过24 h可达透析平衡。对24 h各浓度的蛋白结合率进行t检验，各浓度组间的结合率无明显差异（P＞0．05），即浓度因素对血浆蛋白结合率没有显著影响。WEL与大鼠血浆蛋白的平均结合率为85．5%±2．7%。

3 讨 论

目前研究血浆蛋白结合率的方法主要有平衡透析法、超滤法、超速离心法、高效亲和色谱法（HPAC）和高效前沿分析法（HPFA）等，其中平衡透析法原理简单、操作方便、干扰因素少，是较经典的方法。本实验对样品的处理方法比较多种液-液萃取与蛋白沉淀方法：结果二氯甲烷和甲醇对药物和内标物的提取回收率低，乙酸乙酯易产生乳化现象，丙酮的提取回收率高但是毒性较大，综合考虑最终确定乙腈沉淀蛋白作为样品处理方法，该方法提取回收率高且毒性小。

表2 不同平衡时间下蟛蜞菊内酯与大鼠血浆蛋白结合率（n=5）

WEL与大鼠血浆蛋白结合率的实验表明，WEL在3种浓度下的蛋白结合率未呈现浓度依赖关系，且当达到透析平衡时，WEL与血浆蛋白的平均结合率均大于80%，属于高蛋白结合率药物。由此推测此成分在血浆中主要以结合型存在，半衰期较长。由于游离态药物便于实现完整转运，发挥药效，故建议临床合并使用其他药物，开展体外药物竞争结合实验。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部[S]．北京：中国医药科技出版社，2010：351-2．

[2]Benes P,Knopfova L,Tracka F,et al．Inhibition of topoisomerase IIα:Novel function of wedelolactone[J]．Cancer Lett,2011,303(1):29-38．

[3]Pocas ES,Lopes DV,Silva AJ,et al．Structure-activity relationship of wedelolactone analogues:Structural re-quirements for inhibition of Na+,K+-ATPase and bind-ing to the central benzodiazepine receptor[J]．Bioorgan Med Chem,2006,14(23):7962-6．

[4]刘 晓，刘晓辉，刘文涛，等．阿比朵尔人血浆蛋白结合率的测定[J]．中国新药与临床杂志，2007，26（2）：115-9．

[5]卢来春，蒋学华，杨俊毅，等．阿莫西林对格列美脲血浆蛋白结合率的影响[J]．华西药学杂志，2003，18（4）：246-50．

[6]刘 颖，刘志强，陶蓓蕾，等．蟾毒灵血浆蛋白结合率的测定[J]．中国中药杂志，2009，34（21）：2817-20．

Determination of the Binding Rate of Rat Plasma Protein with Wedelolactone

FANG Yue,HUANG Xue-juan,YOU Xin-yi,YIN Zhi-yong,ZHANG Chao-feng*,ZHANG Mian
Department of Pharmacognosy Research,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective:To study the binding rate of plasma protein with wedelolactone,an accurate and specific high performance liquid chromatography method(HPLC)for quantifying wedelolactone in rat plasma was established．Methods:The equilibrium dialysis combined with HPLC was carried out for the determi-nation of the plasma protein binding rate of wedelocatone．Results:24 h after equilibrium dialysis,the binding rates of plasma protein with wedelolactone at low (0．62 μg·mL-1),middle (3．10 μg·mL-1)and high (9．92 μg·mL-1)concentration were (87．9±2．1)%, (84．7±2．5)%and (83．8±1．9)%,respectively．Conclusion:These results showed the strong binding power of wedelolactone with rat plasma protein．

Wedelolactone;Protein binding rate;Equilibrium dialysis;HPLC

R965

A

1673-7806（2015）03-246-03

大学生创新药物研制能力提高项目（J1030830）；国家级大学生创新创业训练计划项目（2014年）

方悦，女，研究生 E-mail:18252093630@163.com

* *通讯作者张朝凤，女，硕士生导师 E-mail:njchaofeng@126.com

2015-03-02

2015-03-30