胃癌中YAP与β-catenin蛋白表达的临床意义及相关性

官文飞，母 松，蒙长远，张 军

（重庆医科大学附属第一医院胃肠外科，重庆 400016）

YAP（Yes-associated protein）即Yes相关蛋白，是Hippo信号通路中一种起关键作用的连接蛋白和转录共激活因子，通过维持细胞凋亡和增殖之间的平衡，从而调控器官大小发育［1］。已有大量研究表明:YAP在肝癌、卵巢癌和结肠癌等［2-4］肿瘤中表达量增高、活性增强，并与肿瘤的侵袭、淋巴结转移及预后有关，提示其可能参与肿瘤细胞异常增殖和恶性转化。β-链蛋白（β-catenin）是经典 Wnt通路中向细胞核传递信号的重要信号分子，研究证实Wnt信号传导通路异常在促进肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤侵袭转移及免疫逃逸等方面发挥重要作用，细胞内游离的β-catenin水平决定该信号通路活性［5］。现发现Hippo与Wnt信号通路在多种肿瘤的发生、发展过程中有相互影响，协同促进肿瘤的发生［6］，有关人胃癌组织中两信号途径中YAP与β-catenin关键蛋白的表达及相关性研究较少。本实验旨在初步探究 Hippo/YAP和 WnT/β-catenin通路在胃癌中相互作用机制及两者的关系，为胃癌的诊断和治疗积累临床实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2013年10月至2014年7月重庆医科大学附属第一医院胃肠外科手术切除胃癌组织及癌旁正常组织（距癌变部位＞5 cm）各50例，患者术前证实均未接受放疗或化疗，未有远处转移，均有完整临床病理资料。标本留取前已通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会审查批准，并由患者签署知情同意书。其中男性38例，女性12例;年龄28～75岁，平均53.2岁;中位年龄54岁。所有标本分两份分别用10%甲醛固定和液氮罐储存。组织包埋固定供免疫组织化学染色，液氮中标本迅速移至－80℃冰箱保存，用于提取蛋白及RNA。

1.2 主要试剂

兔抗人 YAP多克隆抗体（Santacru公司），β-catenin兔抗人多克隆抗体（Abcam公司），β-actin抗体和二抗（上海生工生物工程有限公司），免疫组化S-P试剂盒、DAB显影液（北京中杉金桥生物技术有限公司），real time试剂盒及引物（TaKaRa公司），Western blot相关试剂（碧云天生物技术研究所）。

1.3 主要方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测YAP和β-catenin mRNA的含量:Trizol法提取总 RNA，反转录为cDNA。YAP、β-catenin表达水平用定量 PCR的SYBR Green法检测，每例重复3次实验。YAP的引物序列为:上游引物5'-TGAACAAACGTCCAGCAA GATAC-3'，下游引物 5'-CAGCCCCCAAAATGAAC AGTAG-3';β-catenin的引物序列为:上游引物5'-GCAGCAACAGTCTTACCT-3'，下游引物 5'-ACAGG ACTTGGGAGGTAT-3';β-actin引物序列为:上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.3.2 免疫组织化学方法检测YAP和β-catenin蛋白的定位及定量:石蜡块组织切片常规脱蜡，柠檬酸缓冲液微波修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，后续步骤按免疫组化试剂盒说明进行。每例标本均对癌组织和癌旁组织染色进行对比。用染色强度联合阳性细胞百分比进行评分［7］:染色强度分4个等级:阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分;阳性细胞百分比为5个等级:阳性细胞＜10%为0分（阴性），10% ～25%为1分，25% ～50%为2分，＞50%为3分;两者之和为3～6分判定为免疫组化阳性。

1.3.3 蛋白质提取和 Western blot检测 YAP和β-catenin蛋白表达量:提取新鲜组织总蛋白，经BCA法定量，调整样本为相同蛋白浓度，取10 μL相同总量蛋白上样，经SDA-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜上，兔抗人 YAP（1∶600稀释）、兔抗人 β-catenin（1∶500稀释），4 ℃孵育过夜，内参 β-actin，室温孵育二抗1 h，显影，Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，通过Quantity one软件分析各条带灰度值。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析，实验数据为正态分布。计数资料的描述统计量以率表示，比较均采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关;计量资料以均数±标准差（±s）表示，运用t检验。

2 结果

2.1 YAP、β-catenin mRNA荧光定量PCR的检测结果

胃癌组织中YAP mRNA水平（2.035±0.900）高于癌旁组织（1.012±0.044）;胃癌组织中β-catenin mRNA水平（3.220±0.142）高于癌旁组织（1.502±0.066）（P＜0.05）。

2.2 YAP、β-catenin蛋白免疫组化检测结果

YAP蛋白在胃癌组织中主要在胞核和（或）胞质中表达，呈棕黄色颗粒，小部分胃癌组织和配对正常组织中未见黄染;β-catenin蛋白在配对正常胃组织中主要为膜表达，在胃癌组织中异常表达，即膜表达缺失或异位表达（胞质或胞核表达）呈黄染颗粒。胃癌组织中YAP和β-catenin蛋白阳性表达率分别为72%（36/50）和64%（32/50），癌旁组织中阳性表达率分别为14%（7/50）和20%（10/50），YAP和β-catenin蛋白在胃癌表达率明显高于配对正常组织（P＜0.05）（图1）。

2.3 YAP、β-catenin蛋白Western blot检测结果

YAP蛋白相对表达量在癌组织1.811±0.021显著高于癌旁组织0.765±0.014（P＜0.05）;βcatenin蛋白相对表达量在癌组织为2.412±0.072显著高于癌旁组织的1.274±0.053（P＜0.05）（图2）。

2.4 YAP、β-catenin蛋白与胃癌患者临床特征的关系

YAP、β-catenin蛋白的表达和TNM分期相关，TNM分期越高，二者表达越强，表达还与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关（P＜0.05），而 YAP、β-catenin蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小无相关性（表1）。结果提示YAP和β-catenin表达与胃癌恶性生物学相关。

2.5 胃癌组织中 YAP、β-catenin蛋白表达的相关性

50例胃癌患者中YAP和β-catenin表达均阳性者30例，均阴性者12例;YAP表达阳性、β-catenin表达阴性者6例;YAP表达阴性、β-catenin表达阳性者2例，经过Pearson等级相关分析:在50例子胃癌组织中，YAP和β-catenin的异常表达呈显著正相关（r=0.72，P ＜0.05）。

图1 YAP和β-catenin蛋白在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达Fig 1 The expression of YAP and β-catenin in GC tissues and paired normal tissues（× 400）

3 讨论

Hippo信号通路在维持器官大小和肿瘤生物学进展方面发挥重要作用［8］，YAP是其中起着开关作用的富脯氨酸的磷蛋白，相对分子质量为65 ku，其编码基因位于人类染色体11q22，而该位置基因在人类多种癌症中都存在扩增或杂合型突变［9］，YAP在多种肿瘤中异常高表达，并与肿瘤的转移和预后密切相关。研究发现，肝癌患者中癌组织较癌旁组织高表达YAP，并与肝癌的分化程度及血清中AFP浓度明显相关，YAP蛋白高表达患者生存率明显低于低表达者［10］。采用siRNA技术干扰胰腺癌细胞YAP基因表达后，BxPc-3、PANC-1细胞增殖抑制［11］。经典Wnt信号通路已被证实在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，β-catenin蛋白是信号通路中关键分子，当Wnt信号激活，β-catenin降解受到抑制，细胞质内β-catenin水平升高，进入胞核激活下游靶基因（如 c-myc、Cyclin D1、c-jun等），促进肿瘤的发生、发展［12］。

图2 Western blot检测癌组织及癌旁组织中YAP和β-catenin蛋白的表达Fig 2 The expression of YAP and β-catenin in GC tissues and paired normal tissues

表1 不同临床病理特征胃癌组织中YAP和β-catenin蛋白表达水平Table 1 The protein expression levels of YAP and β-catenin in GC tissues with different clinicopathologic characteristics

本实验研究证实，YAP和β-catenin在胃癌中的表达均明显高于癌旁组织，且与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，与年龄、性别和肿瘤大小等无关。同时，通过Pearson相关分析发现，同一胃癌组织中YAP与β-catenin高表达呈明显正相关。蒋宁等研究［12］发现Hippo与Wnt信号通路在肿瘤发生、发展过程中存在协同作用，在结肠癌来源的细胞系中敲除YAP基因能显著减弱β-catenin信号通路的传导，抑制细胞增殖和存活［13］。因此我们推测，在胃癌中 Hippo、Wnt信号通路经YAP和β-catenin协同作用促进胃癌细胞的增殖，并抑制其凋亡，促进胃癌的发生和转移，但由于纳入标本量有限，未涉及到分子水平，YAP和β-catenin相互作用的具体机制仍不清楚，需要进一步探究。

综上所述，Hippo、Wnt信号途径中的关键分子YAP、β-catenin与胃癌的恶性生物学行为密切有关，可将YAP和β-catenin两者作为新的生物标记来进行胃癌的筛选、检测和预后评估，同时为进一步阐明Hippo与Wnt信号通路在胃癌发生、发展的协同作用累积了实验依据。

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