重庆地区人群CYP2C19基因型表型多态性分析及检测的临床意义＊

邓济甦，唐翌姝，毕小云

（重庆医科大学附属第一医院检验科 400016）

肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450（cytochrome P450）是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为他们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19酶主要分布在肝脏，同时也广泛分布于肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官，参与多种外源性物质代谢，如：药物、乙醇、抗氧化剂、有机溶剂、染料、环境污染物质等。遗传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异。等位基因编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型（EM）；绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型（PM），这对治疗的个体反应和药物不良反应都产生重要影响。本文通过对重庆地区人群基因组DNA 中CYP2C19基因型的分型检测，判定患者的药物代谢速率类型，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，为降低不良反应提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 56例受试者来源于2012年5月至2013年3月本院进行CYP2C19基因型检测的汉族人群，其中，男42例，女14例。

1.2 标本采集 每位受试者静脉采血2mL，EDTA 抗凝，用于提取DNA。

1.3 试剂与仪器 DNA 提取和杂交试剂由上海百傲科技有限公司提供，批号分别为20120211、20120223。PCR 扩增仪型号TC-96，由杭州博日科技有限公司提供。e-Hyb全自动杂交仪和BE-2.0生物芯片识读仪均由上海百傲科技有限公司生产。金属浴和漩涡振荡器。

1.4 DNA 提 取

1.4.1 吸附柱的活化 将吸附柱置于收集管中，加入500μL缓冲液BH1，静置2～3min，12 000r／min（9 500×g）离心30 s，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500μL缓冲液BH2，12 000r／min（9 500×g）离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中待用。

1.4.2 离心 在离心管中加入20μL 蛋白酶K，将EDTA 抗凝血混匀后吸取200μL 至离心管中，再加入200μL 缓冲液BL，振荡15s，混匀后低速离心，恒温金属浴56 ℃放置10 min，加入无水乙醇200μL，充分颠倒混匀，低速离心。将所得溶液和絮状沉淀都加入一个活化的吸附柱中，12 000r／min（9 500×g）离心1min，弃去装废液的收集管，将吸附柱插入新的收集管中，向吸附柱中加入500μL 缓冲液BW1，12 000r／min（9 500×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，再向吸附柱中加入500μL 缓冲液BW2，12 000r／min（9 500×g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱插入收集管中，12 000r／min（9 500×g）离心1min，将吸附柱转入一个新的洁净的1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60μL 洗脱缓冲液BE，56 ℃放置5min，12 000r／min（9 500×g）离心1min，将溶液收集到离心管中-80 ℃保存备用。

表1 56例受检人群各种基因型分布［n（%）］

1.5 DNA PCR 扩增 试剂从试剂盒中取出解冻后，将CYP2C19扩增液1和扩增液2低速离心分装到0.2mL PCR扩增管中，每管19μL，在各扩增管中分别加入1μL反应液A，5μL提取好的样品DNA 溶液，混匀后瞬时离心，放入PCR 扩增仪中，参照GenBank 设计引物。上游引物：5′-AAT TAC AAC CAG AGC TTG GC-3′；下游引物：5′-TAT CAC TTT CCA TAA AAG CAA-3′。按下列条件扩增：50 ℃5min 1个循环；94 ℃5min 1个循环；94 ℃25s，48 ℃40s，72 ℃30s，35个循环；72 ℃5min 1个循环。扩增产物放入2～8 ℃冰箱中保存备用。

1.6 杂交显色和扫描 将反应液B低速离心，吸取10μL 加入杂交缓冲液瓶中混匀成为杂交反应液，取出1支抗体低速离心，加入1mL抗体稀释剂，混匀备用。吸取180μL 杂交反应液，加入10μL CYP2C19扩增产物1和扩增产物2，混匀待用。准备各管试剂于2mL 离心管中，按要求加入相应的试剂，插入试管盒相应位置中，设置百傲e-Hyb全自动杂交仪杂交程序，取出基因芯片插入杂交仪插片口中，将试管盒放入杂交仪中，运行杂交程序。杂交结束取出芯片用蒸馏水冲洗芯片表面，自然晾干，启动BE-2.0生物芯片识读仪，进行扫描分析，得出基因分型结果。

2 结 果

2.1 56例检测人群进行基因分型后的分布情况 男性中基因型为野生型纯合子＊1／＊1（636GG，681GG）占40.47%（17／42），基因型为杂合子＊1／＊2（636GG，681GA）和＊1／＊2（636AG，681GG）占50.00%（21／42），基因型为突变型纯合子＊2／＊2（636GG，681AA）和＊2／＊2（636AA，681GG）占9.53%（4／42）；而女性中基因型为野生型纯合子＊1／＊1 占57.14%（8／14），基因型为杂合子＊1／＊2和＊1／＊2占35.71%（5／14），基因型为突变型纯合子＊2／＊2和＊2／＊2占7.14%（1／14）。见表1。

2.2 56例检测人群CYP2C19快、慢代谢结果 男性快代谢占90.47%，女性快代谢占92.86%，男性慢代谢占9.53%，女性慢代谢占8.93%，男女总快代谢占91.07%，男女总慢代谢占8.93%。见表2。

表2 56例受检人群CYP2C19快、慢代谢结果

3 讨 论

个体间药物反应差异是许多药物临床使用时面临疗效不佳或药物中毒的一个重要问题，其主要原因之一就是肝脏相关药物代谢酶活性存在很大的可变性，造成这种可变性的原因包括了遗传和非遗传的因素。遗传学改变导致的代谢酶表现出遗传多态性，具体体现在由等位基因编码的代谢酶，其代谢能力大相径庭：野生型的正常等位基因通常表现为快代谢型；而绝大多数突变型等位基因，因为碱基的突变等而影响了酶活性，表现为代谢能力明显下降，称为慢代谢型，其中，慢代谢型发生往往存在明显的个体、种族和地域的差异性，进而导致在治疗过程中，对个体反应和药物不良反应等产生重要影响［1］。

细胞色素P450（cytochrome P450）是肝细胞代谢中的关键代谢酶之一，其中，CYP2C 亚家族中的CYP2C19亚型在药物反应中发挥着至关重要的作用。大量研究显示，CYP2C19参与了多种药物的代谢，如质子泵抑制剂（奥美拉唑、兰索拉唑），抗痉挛药物（S-美芬妥因）等［2-4］，CYP2C19活性表现出的明显个体差异及双峰性分布正是人们所熟知的基因多态性。而正是由于CYP2C19基因多态性产生了血药浓度的个体差异，严重干扰了治疗效果。1989年，Wilkinson等［5］根据美芬妥因的代谢差异将个体分为快代谢型和慢代谢型两种亚型，其中慢代谢型存在S-美芬妥因-4′羟化酶（即现在的CYP2C19）的缺陷，这种缺陷在中国汉族人群中的比例达22.5%［6］。研究显示［7］CYP2C19存在多种突变基因和等位基因突变。CYP2C19＊1作为野生型基因能够编码正常酶活性，其等位基因则包括了＊1……＊17。而CYP2C19＊2（ml突变）和CYP2C19＊2（m2 突变）等位基因占东方人慢代谢型的99%以上。其中，最主要的CYP2C19＊2等位基因变异是由于外显子5第681位处的碱基发生变异（G／A），从而导致了异常剪接点的形成和阅读框的移位，产生一个提前终止密码子和截短的蛋白；而CYP2C19＊2等位基因则在第4外显子的636位发生G／A 突变，同样产生了提前的终止密码，导致蛋白合成终止，两种突变均引起CYP2C19酶活性的丧失。慢代谢型患者通过该酶代谢的药物随患者基因型不同，其疗效和不良反应也有明显不同［7］。

因此，检测CYP2C19酶对药物代谢速率的快、慢，可以合理调整药物剂量，提高疗效、降低不良反应发生概率。临床上有许多药物经过CYP2C19 的代谢，其中包括质子泵抑制剂：奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑等；抗抑郁药：氟西汀、西酞普兰、艾司西酞普兰、阿米替林、氯米帕明、丙咪嗪、吗氯贝胺、曲米帕明、依替唑仑等；抗癫痫药：安定、氯巴占、苯妥英钠、苯巴比妥、丙戊酸等；抗肿瘤药：环磷酰胺等；血小板聚集抑制剂：氯吡格雷等；抗疟疾药：氯胍等；抗真菌药：伏立康唑等；孕激素：黄体酮等。

CYP2C19酶集中分布于肝脏，但是在其他众多器官也有一定量的分布，如脑、胃肠道、肺等。研究证明CYP2C19基因多态性与神经系统、消化系统、心血管等药物使用均产生了明显的影响。在神经系统使用的药物中，CYP2C19的多态性差异导致血浆中药物（如苯妥英钠）的清除率明显下降［8-9］，携带CYP2C19突变的患者丙戊酸（VPA）等药物血药浓度升高，分布曲线明显右移［10］。由此可见，CYP2C19酶突变导致PM 患者药物代谢延缓，血药浓度较高，进而增强了药物的疗效。黄越等［11］也证明多数CYP2C19正常代谢患者，在进行抗癫痫治疗时，其VPA 的血药浓度无法达到治疗血药浓度。值得注意的是，血药浓度高虽然能增强药物的疗效，但是也增加了不良反应的发生率，尤其是抗癫药物，由于其中毒剂量与治疗有效剂量十分接近，剂量的微小偏差就可能引起药物中毒。消化系统用药中，受CYP2C19影响最大的是质子泵抑制剂（PPI），其中，第一代PPI主要在肝脏代谢，对于p450酶的依赖性强，无论是口服给药还是静脉注射，CYP2C19的多态性对于这类药物（奥美拉唑和兰索拉唑）都有着明显的影响，PM 的血药浓度相对较高，而快代谢型患者由于血药浓度低，往往需要增大剂量才能达到预期的治疗效果［12］。除此之外，研究显示CYP2C19＊2会增加接受氯吡格雷治疗急性冠状动脉综合征（ACSs）患者发生严重不良心血管事件的风险，尤其是那些接受经皮冠状动脉介入（PCI）治疗的患者，提示CYP2C19 基因型导向的抗血小板治疗在心血管疾病治疗中的重要性［13］。Tantry等［14］研究进一步证明CYP2C19基因型会对氯吡格雷抑制血小板的效应产生影响，而对替卡格雷治疗效果则无干扰。由此可见，通过检测CYP2C19基因型对于患者药物的正确选择有着十分关键的作用。

因而，分析CYP2C19 基因多态性，深入了解药物受CYP2C19影响及二者相互作用，对于指导临床个性化用药治疗奠定了基础。本研究对重庆市56例受试者进行CYP2C19基因多态性检测，结果男性中基因型为野生型纯合子＊1／＊1wt／wt占40.47%（17／42），基因型为杂合子＊1／＊2（wt／m1）占38.09%（16／42）和＊1／＊2（wt／m2）占11.90%（5／42），基因型为突变型纯合子＊2／＊2（m1／m1）和＊2／＊2（m2／m2）占9.53%（4／42）；而女性中基因型为野生型纯合子＊1／＊1（wt／wt）占57.14%（8／14），基因型为杂合子＊1／＊2（wt／m1）和＊1／＊2（wt／m2）占35.71%（5／14），基因型为突变型纯合子＊2／＊2（m1／m1）和＊2／＊2（m2／m2）占7.14%（1／14）。在本实验中未发现＊2／＊2（m1／m2）基因型。在重庆地区男性和女性受试者中，（wt／wt）和（ml／ml）的发生率无显著差别。性别对重庆地区汉族人群细胞色素氧化酶CYP2C19遗传多态性的影响在统计学上无差别。男性快代谢占90.47%，慢代谢占9.53%，女性快代谢占92.86%，慢代谢占7.14%，与牛春燕等［15］报道一致。

随着人类基因组研究的快速发展，个性化用药引起了广泛的关注，越来越多临床医生意识到了其重要性。由于药物反应存在的个体性差异，根据临床常规剂量进行治疗，可能会引起部分患者血药浓度过高而产生中毒反应，或者血药浓度低无法达到预期疗效。因而利用有效的基因检测方法帮助了解患者的基因型，根据基因多态性进行用药，为药物的选择和剂量的调整提供了新的指针，能够更好地实现疗效最佳、不良反应最少的个性化治疗。相信不远的将来，基因检测导向的个性化治疗将广泛用于临床并成为临床治疗的重要手段。基因芯片检测CYP2C19基因型，一次检测，患者终身适用。同时指导了医生用药，让患者在最短的时间，以最低的费用，达到最好的治疗效果。避免用药无效、毒副反应的发生，为临床诊疗提供了有力的实验室依据。不足之处，本研究中受试者数量较少，研究不全面，需要继续增加样本量，进行进一步的研究探讨。

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