循环microRNA在肝细胞肝癌诊断研究中的新进展

陈 义 综述，黄 平审校

（重庆医科大学附属第一医院肝胆外科 400016）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内广泛分布的排名第5位的最常见的恶性肿瘤。根据对“the Global Burden of Disease Study 2010”的解析，在全球范围内癌症相关死亡的癌症中，肝癌排名第2；根据1990～2010年中国健康状况迅速改变的统计分析，在中国癌症相关死亡的疾病中肝癌仅次于肺癌，排名第2。由于早期诊断困难，只有30%～40%的患者能获得根治性治疗［1］。许多研究表明，在肝细胞肝癌中，microRNA 通常以类似促癌基因和抑癌基因的方式执行其生物学功能，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、肿瘤血管形成、浸润和转移等生物学行为。

近几年，学者通过研究发现，虽然microRNA 很容易降解，但在循环中却能稳定的表达。Chen等［2］研究证实，microRNA能在血清中稳定表达，能抵制核糖核酸酶A 的降解，甚至在pH 为1或13的溶液中保持稳定。基于此类研究的发现，从2010年开始，国内外学者对HCC患者循环中的microRNA 进行研究，取得了一定的成绩，并为HCC 诊断开辟了新的研究方向。

1 HCC和microRNA

随着现代癌症研究的进展，越来越多的证据表明，microRNA 参与癌症发生、发展的进程。多种microRNA 在HCC 的不同阶段均有异常表达，并作为致癌基因或者抑癌基因参与HCC的多种生物学行为，包括HCC的发生、增殖、分化、浸润、凋亡等诸多环节。到目前为止，很多研究都关注HCC 肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织或者正常肝组织中microRNA 表达量的异常，并通过重组DNA 技术或者RNA 干扰技术来验证microRNA 的靶基因及其对细胞生物学行为的调节作用。研究最多的为miR-21、miR-122和miR-221等。

1.1 HCC中miR-21 调控机制和作用研究 几乎在所有的HCC患者肿瘤组织中miR-21 表达上调［3-5］，证明该microRNA 的表达稳定，这也是很多学者选择对其研究的原因。Zhu等［3］研究指出，表达量增加的miR-21 抑制其靶基因PDCD4的表达，上调其下游信号通路关键分子磷酸化原癌基因c-Jun，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）如MMP-2和MMP-9，促使癌细胞的转移和浸润。Bao等［4］发现miR-21抑制抑癌基因PTEN 和硫酸酯酶-1（hSulf-1）的表达，从而激活PI3 K-protein kinase B（AKT）／extracellular signal regulated kinase（ERK）通路和上皮间质转化（EMT），促进HCC 细胞的增殖和运动。Karakatsanis等［5］研究发现，miR-21 还与HCC预后相关。

1.2 HCC 中miR-122调控机制研究 miR-122一直被学者认为是肝特异性microRNA，占正常肝组织microRNA 表达量的70%［6］。miR-122是研究生物学标记物的理想对象，所以，miR-122备受许多学者青睐。miR-122 在许多学者看来是作为抑癌基因存在的，因此，在HCC 组织中其表达量下降，事实上，现在的研究几乎都支持miR-122在HCC 组织中稳定地表达下调。Xu等［7］研究证明，miR-122在HCC 组织和肝癌细胞株中表达下调，提高miR-122的表达水平可抑制HCC 细胞的生长和促进其凋亡，具体的靶点为Wnt1／β-catenin通路。由于乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是造成HCC的2大危险因素，所以，有学者探查miR-122在HBV 或者HCV 感染的情况下HCC形成过程中的作用。Li等［8］研究指出，HBV mRNA 绑定在miR-122互补区域，隔绝miR-122，使其靶点PBF［pituitary tumor-transforming gene 1（PTTG1）binding factor］基因表达上调，促进HCC 细胞的增殖和浸润。Zhao等［9］研究发现，HCV RNA 能绑定microRNA-122并形成Ago2-HCV-miR-122复合物，稳定HCV 基因并增强HCV 的复制。由于HCV RNA 的绑定作用，miR-122的靶点——癌基因cyclin G1（CCNG1）被释放，促进HCC的形成。

1.3 HCC 中miR-221调控机制研究 miR-221在人体多种癌症中表达量增加，而且稳定性好，如乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、胃癌及甲状腺癌等［10-11］。在HCC组织样本中，约70%的样本呈现出高表达的情况。Rong等［12］通过体外细胞试验研究发现，阻滞miR-221，能抑制HCC 细胞生长，使其停留在G1／S期，促使其凋亡。相似的结果同样被Chen等［13］证实。Rong等［12］同时证实miR-221在有转移的样本中表达量更高，并提示miR-221与较短的复发期相关，其靶基因为CDKN1C／P57和CDKN1B／P27。

2 循环microRNA 作为HCC肿瘤标记物的研究进展

选取HCC 组织标本作为研究对象，不仅对HCC 中microRNA 表达量的差异和作用机制的研究有意义，而且对HCC预后的判断也有意义。然而，对HCC 的术前诊断及手术后效果的术前预判价值不大。

现代HCC 诊断标记物的缺陷及对HCC 早期诊断的不足，迫切需要新的HCC 标记物问世。microRNA 的出现及其与HCC关系为寻找新的灵敏度和特异度都高的肿瘤标记物带来了希望。

从2008年起，许多学者发现，microRNA 能稳定地出现在循环中，2010年开始就有关于HCC 患者循环microRNA 作为肿瘤标记物的报告，从此开启了循环microRNA 对HCC 诊断价值的论证之路。

2.1 单个microRNA 的诊断价值研究 （1）表达量减少的循环microRNA。Luo等［14］研究表明，miR-122a在HCC 患者与健康人群的血清中表达量有差别，且在HCC 患者中表达量下降，经过验证，曲线下面积（AUC）为0.707，灵敏度为70.6%，特异度为67.1%，与AFP比较没有优势，但与HCC 的危险因素（如性别、吸烟史、酗酒、HCC 家族史及HBV 感染）相关。（2）表达量增加的循环microRNA。①有潜在价值作为肝病标记物的循环microRNA。Qi等［15］研究指出，miR-122 在区分HCC和健康人群时，AUC为0.869。取值0.475时，灵敏度和特异度分别为81.6%和83.3%。但不能区别HCC 和HBV感染患者，故只有可能作为肝病诊断的标记物。Gui等［16］用HCC、肝硬化、慢性乙型肝炎、胃癌患者和健康人群血清进行试验，筛查出miR-885-5p具有肝病特异性，临界值为1.06时，区别肝病和控制组，AUC 达0.904，灵敏度为90.5%，特异度为79.2%。建议可把miR-885-5p作为肝病（包括HCC）有潜力的标记物，但并不能把HCC 从肝病中区别出来。②有潜在价值区别HCC 和肝病的循环microRNA，Tomimaru等［17］发现，miR-21单独作为标记物，区分HCC 和健康人群，AUC 为0.953，灵敏度为87.3%，特异度为92%；区分HCC 和慢性肝炎，AUC 为0.773，灵敏度为61.1%，特异度为83.3%。Li等［18］指出，MiR-18a在区分HBV 相关HCC组和健康控制组，AUC为0.881，灵敏度为86.1%，特异度为75.0%；在区分HBV 相 关HCC 组 和 肝 硬 化 组，AUC 为0.775，灵 敏 度 为77.2%，特异度为70.0%。以上一系列研究可以看出，单个microRNA 在区别HCC患者和健康人群时，诊断价值高，但在区别HCC和肝病患者时，诊断价值有限。

2.2 多个microRNA 及microRNA 与其他肿瘤标记物联合的诊断价值研究 基于单个microRNA 在区别HCC 和肝病普遍都存在灵敏度或者特异度不高的问题。许多学者进行多个microRNA 联合诊断，或者与传统HCC 肿瘤标记物进行联合诊断的研究，试图找到更加理想的诊断方法。

2.2.1 microRNA 与传统HCC 肿瘤标记物的联合诊断价值研究 由于miR-21在区别HCC和肝病方面存在的不足，Tomimaru等［17］进一步研究发现，若miR-21与AFP 联合，在区别HCC和对照组时，AUC 为0.971，灵敏度和特异度分别为92.9%和90.0%。Qu等［19］研究表明，miR-16和miR-199a在区别HCC和慢性肝病方面，比传统的标记物AFP、AFP-L3%和DCP 的灵敏度高，miR-16、AFP、AFP-L3%和DCP 的联合灵敏度可达92.4%，特异度为78.5%，并建议把miR-16作为传统标记物的补充。

2.2.2 多个microRNA 联合的诊断价值研究 Liu等［20］指出，联合miR-130b和miR-15b进行临床验证，鉴别HCC，AUC为0.98，灵敏度为98.2%，特异度为91.5%。即使AFP＜20 ng／mL，灵敏度也达96.7%。在AFP 不能诊断的HCC 早期阶段，同样能鉴别出HCC。Li等［21］选取HBV 携带者、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、HBV 阳性HCC 患者及健康人群血清进行试验，试图找到诊断HBV 感染和HBV 阳性HCC的标记物。结果发现miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b／a、miR-342-3p、miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150和let-7c在HBV 感染者血清中表达量增多，而且还能将HBV 阳性HCC样本从HBV 样本中区分。诊断价值试验证明，联合miR-23b、miR-423、miR-375、miR-23a和miR-342-3p，区别HBV 阳 性HCC 组 和 控 制 组，AUC 达99.9%。联 合miR-10a和miR-125b能将HBV 阳性HCC 从HBV 感染组中区分出，AUC 为（99.2±0.6）%，灵敏度为98.5%；特异度为98.5%。Zhou等［1］研究指出，miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801联合，在AFP＜400ng／mL组，其AUC 为0.879（95%CI为0.839～0.912；灵 敏 度 为77.7%，特异度为84.5%）；在AFP＞400ng／mL 组，AUC 为0.910（95%CI为0.867～0.942，灵敏度为87.7%，特异度为83.5%）。区分HCC组和慢性乙型肝炎组，AUC 为0.842，灵敏度为79.1%，特异度为76.4%；区分HCC 组与肝硬化组，AUC为0.884，灵敏度为75%，特异度为91.1%。表现出了比传统标记物更好的诊断价值。

2.3 尿液中循环microRNA 诊断价值的研究 为了寻求更加简便、无创的诊断方法，有学者试图通过尿液寻找HCC 肿瘤标记物。因为HCV 感染是HCC 形成的危险因数之一，有研究［22-25］选取HCV 阳性HCC、慢性HCV 感染患者和健康人群的尿液进行筛查，将HCV 阳性HCC患者从HCV 感染患者中区分出，miR-618敏感度为64%，特异度为68.0%；miR-650敏感度为72.0%，特异度为58.0%。虽然研究者在尿液中并没有发现理想的肿瘤标记物，但其扩展了循环microRNA 研究的范畴，为进一步的研究树立了榜样。上述研究相关数据见表1、表2。

表1 HCC中循环microRNA 表达量改变

表2 循环microRNA 及其联合对HCC的诊断价值

续表2 循环microRNA及其联合对HCC的诊断价值

3 展 望

现有HCC肿瘤标记物特异度和灵敏度的不足，促使对理想HCC特异性肿瘤标记物的寻找。理想的肿瘤标记物应该具备2大特性，即灵敏度高、特异度高。从表2可见，有的microRNA 显示出了很好的特异度及灵敏度，如miR-130b、miR-21、miR-122。但实验仍有不足之处，如miR-130b在区分HCC患者和健康人群时，ROC 曲线下面积为0.913，灵敏度为87.7%，特异度为81.4%，似乎已经比传统的AFP、DCP 等标记物好。但没有关于区分HCC 和HBV 感染、肝硬化及HCV感染的研究。这表明，现在研究认为很有希望成为理想的HCC肿瘤标记物的microRNA，从实验到临床应用的转变，仍有许多工作要做。怎样筛选最佳microRNA 及其组合，并进行科学的验证，是需要解决的问题。

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