缝隙连接蛋白pannexin1在神经病理性疼痛大鼠脊髓背角的表达变化

周功锐，包晓航，毛庆祥，龙宗泓，景 胜，黄 静，杨天德

（第三军医大学新桥医院麻醉科，重庆400037）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是感觉神经系统损伤引起的一种慢性疼痛综合征，临床上以自发痛、诱发痛、痛觉过敏、痛觉超敏以及疼痛异常为特征。由于其发病机制复杂，尚无特别有效的治疗手段，近年来越来越成为疼痛领域研究的热点。而星形胶质细胞被认为是NP激活的重要靶点，探索其分子机制有可能为临床疼痛治疗提供新的思路。pannexin（PX）通道蛋白是一类缝隙连接蛋白（gap junction，GJ），目前发现存在3种亚型，PX1、PX2、PX3，以PX1表达最多，广泛存在于全身大部分组织，尤其在神经系统中大量表达。它能连接两个相邻细胞，也能形成半通道与细胞外液想通，能够实现离子及小分子物质在细胞和组织液间的快速交换。有研究发现，星形胶质细胞上PX 半通道能够通过控制ATP的释放和调节钙离子的内流，影响星形胶质细胞的激活状态［1］。本研究旨在通过建立坐骨神经分支选择性结扎模型（spared nerve injury，SNI），观察大鼠脊髓上PX1蛋白的表达变化以及通过鞘内注射GJ阻断剂甘珀酸（carbenoxolone，CBX），分析其与星形胶质细胞的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂和仪器：PX1 兔多克隆抗体（美国，Sigma）；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔多克隆抗体（北京，中杉金桥）；生物素抗兔二抗（美国，Vector）；辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（北京，中杉金桥）；CM1900冰冻切片机及激光扫描显微镜（德国，Leica）；组织蛋白裂解试剂盒（上海，贝博）；化学发光试剂盒（武汉，博士德）；3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色液试剂盒（北京，中杉金桥）；CBX 试剂（美国，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型制备 健康SD 雄性大鼠50只，体质量180～200g，由新桥医院动物实验中心提供。将50只大鼠分为3组：对照组（WT 组，n＝10）、假手术组（sham 组，n＝10）、SNI组（n＝30）。SNI组：按Decosterd等［2］的方法建立动物模型。大鼠麻醉（2%戊巴比妥钠50 mg／kg，腹腔注射）后取俯卧位，备皮，消毒后切开大鼠右侧大腿后外侧，暴露坐骨神经及其分支，远端结扎并剪断腓总神经和胫神经，保留腓肠神经，最后逐层缝合肌肉和皮肤。sham 组：大鼠行假手术，在暴露分离坐骨神经后，不作任何处理，直接缝合肌肉和皮肤。WT 组：大鼠不作任何处理。整个手术过程注意动作轻柔，避免牵拉和损伤腓肠神经，术后均肌内注射青霉素预防感染。术后于动物房室温，单笼饲养。

1.2.2 Western blot法测定脊髓PX1 蛋白表达 SNI组20只大鼠，分别于术后3、5、7、14d（5 只／每个时段）麻醉后处死，分别取其L4～6段脊髓组织；sham、WT 组各5 只大鼠于术后14d麻醉后处死，分别取其L4～6段脊髓组织，加入裂解液冰上匀浆，10 000r／min 离心5 min 后取上清液，核酸浓度仪（Thermo公司）测定蛋白浓度，调定浓度为4μg／uL，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸5min。等量蛋白样品经过电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，PX1一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，隔日加入HRP标记的二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1h，ECL 化学发光系统显色。Quantity One软件分析结果。

1.2.3 大鼠鞘内模型制备 选取SNI组10 只大鼠于建立SNI模型前进行鞘内模型制备，方法参照文献［3］。大鼠麻醉（2%戊巴比妥钠50mg／kg，腹腔注射）后取俯卧位，L4～6处切开皮肤，钝性分离脊柱两侧肌肉，暴露L4～5椎板，剪去部分L5棘突，用5mL注射器针头刺破黄韧带同时见清亮液体流出，遂将拉细的硬膜外导管沿相同路径置入，见大鼠甩尾即置管成功。固定导管，逐层缝合伤口，封闭导管外口。术后第3天导管注入1%利多卡因10μL，有下肢麻痹症状的大鼠再按前述方法制备SNI模型。10只大鼠在SNI术后7d分成两组，5只鞘内注射20μL生理盐水（SNI＋NS组），另外5只注射20μL 0.5g／L CBX 溶液（SNI＋CBX 组）［4］。

1.2.4 GFAP免疫组织化学染色 术后7d取WT（n＝5）、sham（n＝5）、SNI＋NS（n＝5），SNI＋CBX（n＝5）4组大鼠，麻醉（2%戊巴比妥钠60 mg／kg，腹腔注射）后剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针并固定，同时剪开右心耳。首先用0.01 mol PBS液灌注约200mL至肝脏变白后再用4 ℃的4%多聚甲醛灌注约300 mL。小心取出大鼠脊髓组织L4～6段，放置4%多聚甲醛中4 ℃过夜，再放于30%蔗糖溶液中脱水至组织沉底。取出标本，用冰冻切片包埋剂（北京，中山金桥）包埋，制作冰冻冠状切片（厚度40μm），各标本分别取5 张切片染色。切片经3%H2O2洗脱、Triton X-100 打孔，牛血清封闭后，加GFAP多克隆抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜；隔日0.01 mol PBS漂洗后，加入生物素二抗（1∶200）37 ℃孵育2h，再加入链霉亲和素-生物素复合物（SABC）三抗37 ℃孵育1h，最后滴加DAB液经化学反应后显色，封片剂封片。每张切片在显微镜下观察，计算每张切片伤侧脊髓背角每平方毫米GFAP表达数目，取平均值进行统计分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行分析，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内各指标比较用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脊髓PX1 蛋白表达 与WT、sham 组比较，SNI组术后3dPX1蛋白表达开始升高，术后5、7d一直持续高表达，至14d趋于稳定，仍高于WT、sham 组（P＜0.05）。SNI组术后3、5、7、14d表达差异无统计学意义（P＞0.05）。WT、sham 组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组大鼠脊髓PX1蛋白表达

图2 术后7d各组大鼠脊髓背角GFAP免疫组化图像

2.2 各组大鼠脊髓背角GFAP表达 术后7dSNI组大鼠脊髓伤侧背角GFAP表达较WT、sham 组明显增强（P＜0.05），SNI＋CBX 组较SNI＋NS组的脊髓背角GFAP表达下调（P＜0.05），但仍高于WT、sham 组（P＜0.05）。sham、WT 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、3。

图3 术后7d各组大鼠脊髓背角GFAP表达比较

3 讨 论

近年来，随着对疼痛研究的不断深入，研究者发现脊髓内的胶质细胞在病理性疼痛的产生和维持中起着重要的作用。在坐骨神经慢性压迫型模型（CCI）、部分坐骨神经结扎伤模型（PSNL）、L5脊神经冷冻模型中均观察到脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞激活的反应。多种疼痛相关物质可以引起胶质细胞的活化。缩胆囊素和缓激肽可以与星形胶质细胞上的受体结合，激活胞内由Ca2＋介导的信号转导通路［5］。活化的胶质细胞可以通过释放多种神经活性物质ROS、NO、EAAs、ATP等，直接影响神经元的可塑性，使病理性疼痛进一步发展和持续［6］。作为神经免疫细胞，又可以通过合成和释放多种炎性细胞介质如白细胞介素、TNF-α产生致痛作用［5］。而阻断脊髓胶质细胞活化则可以抑制或减轻痛敏反应［7］。越来越多的研究表明，调控星形胶质细胞已经成为疼痛研究的一个重要方向。

GJ是连接两个相邻细胞的大通道，能够实现离子及小分子物质在细胞间的快速交换，尤其在神经系统中大量表达。之前的研究表明这些细胞间的缝隙连接通道均由缝隙连接蛋白Connexin（CX）构成，不同于CX 蛋白形成细胞间连接，新发现的PX 作为GJ中的一类新蛋白，主要是以半通道单体的形式存在，调节ATP、Ca2＋等分子直接与细胞外液间的交换［8-9］。其作为细胞信息与外界交换的一种补充，极大地丰富了神经细胞间信息的交换和整合。本研究通过分支选择性结扎坐骨神经建立NP模型，研究PX1在脊髓中的表达变化。通过Western blot检测，发现术后3、5、7、14d大鼠脊髓PX1表达量较WT、sham 组明显上调（P＜0.05）。在术后5～7d，其表达量达到一个峰值，随后逐渐下降，在14d时趋于平稳。SNI组表达量的明显增高，提示PX1 可能参与了疼痛的激活和调控。CBX作为目前惟一相对特异非选择性的GJ阻断剂，有研究已经证实其可以阻断缝隙连接通道，导致离子或其他分子交换减少甚至停止。GFAP作为星形胶质细胞的特异性标志物，已经得到大量研究证实。本研究免疫组化中发现，SNI组与其他两组比较，脊髓背角中GFAP 阳性细胞个数明显增多（P＜0.05）。在术后7d进行鞘内注射CBX 后，GFAP 阳性细胞个数较未注射的SNI组有明显的下降（P＜0.05）。由此，可以推测PX1这类GJ可能与星形胶质细胞的表达激活有关。

以前的研究大量集中在CX 上，但是近年来，自从其同源蛋白PX 在2004年被克隆出来后，又成为研究的热点。PX1蛋白参与了很多重要的病理生理过程。PX1参与了机体免疫应答及炎性反应，巨噬细胞可能由PX1 通道介导IL-1β 释放［10-11］；红细胞膜上PX1半通道可介导ATP释放从而对局部血流进行调节［12］；PX1 还能够抑制胶质瘤细胞的正常增殖［13］。由于PX 不同于CX 组成的六聚体细胞间通道，只能形成三聚体的半通道。它的功能和CX 相比较类似但又不完全一样，而这二者谁在疼痛信号的传递上起着更为重要的作用，需进一步探究［14］。由于CBX 是非选择性的GJ阻断剂，在二者的功能研究上很难以进行区分和鉴别。寻找更好、更特异的GJ阻断剂，能分别阻断两种同源蛋白通道，将为下一步研究提供更好的帮助，同时为疼痛药物的研发提供方向。

综上所述，缝隙连接蛋白PX1确实在NP 的发生、发展中起着重要作用。至于PX1半通道如何调控星形胶质细胞，如何进一步整合和传递胶质细胞间的信息，还有待进一步的研究。

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