亚硝酸钠短期暴露对雄性小鼠生殖的影响

何杰明 王丽丽 王尚明 张 斌 王 宁，＊ 徐 军

1.北京市中关村中学 （100086）；2.国家人口计生委科学技术研究所

亚硝酸盐广泛存在于熏制和腌制食品中，人体接触亚硝酸盐的机会也不断增加［1］。越来越多的基础和临床研究提示亚硝酸盐可以影响人类的健康，研究主要集中于亚硝酸盐对肝、肾等组织的影响，亚硝酸盐的致癌性等方面。硝酸盐、亚硝酸盐可能与人类先天畸形之间存在病因关联［2］。目前由于男性精液质量的下降导致不孕不育明显呈上升趋势，并且呈现低龄化倾向［3］。因此，本研究通过探讨亚硝酸钠对雄性小鼠生殖功能的影响，从而阐释亚硝酸盐与男性生殖力的关联性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择8周龄雄性昆明小鼠［SPF级，SCXK－（军）2007－004］50只，体重25～30g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。在SPF级动物实验室恒温恒湿屏障环境饲养观察1周后进行实验。

1.2 主要试剂和仪器

亚硝酸钠由国药集团化学试剂有限公司生产，批号20140103；DMEM／F12培养液，Wincent公司生产，批号：319080－cl；显微镜，Olympus公司，日本。

1.3 溶液配制

国家规定肉制品中亚硝酸盐的残留量≤30～50 mg／kg，按此换算小鼠的等效剂量做为本底对照组小鼠给药剂量。分别配制0.01、0.2、0.4、0.8mg／ml亚硝酸钠溶液。每日灌胃给药100μl，达到0.2 mg／（kg·d）。再分别设低［4mg／（kg·d）］、中［8 mg／（kg·d）］、高［16mg／（kg·d）］3个剂量组为实验组，并设正常对照组［4］。各组动物以体重均衡随机分组。

1.4 脏器系数、指数计算方法

脏器系数＝脏器重量（g）／体重（100g）；肝脾指数＝肝重量（g）／脾重量（g）

1.5 试验方法

1.5.1 动物处理方法 每组10只，按照相应剂量每天灌胃给药，连续5d，饲养37d后，期间观察染毒和饲养期间小鼠的生长发育、体重增长情况。称量雄性小鼠体重，摘眼球取血，断脊处死，解剖各种组织器官，睾丸、附睾分别称重计算睾丸脏器系数。

1.5.2 精子计数 取出附睾计数精子，观察其活动度。精子分析方法为双侧附睾称重后，置于2ml DMEM培养液（37℃ 预温）的小平皿中，用眼科剪剪碎，吸管吹打，于显微镜下观察计数［5］。

1.5.3 病理学观察 每只小鼠一侧睾丸使用多聚甲醛固定做常规病理学切片、HE染色，观察睾丸组织病理学形态改变。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 亚硝酸钠短期暴露对小鼠体重和主要组织器官的影响

由表1可见，雄鼠在短期喂食亚硝酸盐后，与正常对照组相比，本底对照组体重增加明显，低中高剂量组小鼠体重增加尤为明显（P＜0.05）。肝和脾的组织重量增加，肝、脾的脏器系数增加明显（P＜0.05）。肝脾指数变化不明显。

表1 亚硝酸钠短期暴露后小鼠体重及身体系数指标情况（）

表1 亚硝酸钠短期暴露后小鼠体重及身体系数指标情况（）

与正常对照组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 与本底对照组比较＃P＜0.05 △P＜0.01

组别 例数 体重增加（g） 肝脏指数 脾脏指数 肝脾指数正常对照组 10 5.647±3.70 3.98±0.26 0.204±0.018 20.025±3.41本底对照组 10 7.738±3.07＊ 4.64±0.047＊＊ 0.202±0.030 20.345±1.52低 剂 量组 10 11.359±1.29＊＊＃ 4.88±0.50＊＊ 0.224±0.047 20.311±3.05中 剂 量组 10 11.837±3.37＊＊＃ 4.84±0.26＊＊ 0.237±0.039＊＊△ 20.892±3.08高 剂 量组 10 12.593±3.69＊＊＃ 4.89±0.21＊＊ 0.241±0.046＊＊△ 18.849±3.42

2.2 亚硝酸钠短期暴露对小鼠生殖器官指数的影响

由表2可见，小鼠睾丸指数与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）；亚硝酸盐中高剂量组附睾指数低于对照组（P＜0.05）。

2.3 亚硝酸钠短期暴露对小鼠计数精子和精子功能指标的影响

由表3可见，与正常对照组相比，小鼠喂食亚硝酸钠后精子总数明显下降（P＜0.05）；实验组与本底对照组相比，精子总数无差异（P＞0.05）。除高剂量暴露组c级精子比例下降有统计学差异，实验组与正常对照组和本底对照的a、b、c级精子所占比例比较，差异均无统计学差异（P＞0.05）；实验组精子活率与本底对照比较无统计学差异（P＞0.05）；与正常对照相比，中剂量和高剂量的亚硝酸钠暴露使精子活率明显下降（P＜0.05）。

表2 亚硝酸钠短期暴露后小鼠睾丸和附睾脏器系数（）

表2 亚硝酸钠短期暴露后小鼠睾丸和附睾脏器系数（）

与正常对照组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01与本底对照组比较＃P＜0.05 △P＜0.01

组别 例数 睾丸指数 附睾指数正常对照组 10 0.598±0.093 0.174±0.013本底对照组 10 0.562±0.064 0.172±0.009低 剂 量组 10 0.549±0.058 0.159±0.010中 剂 量组 10 0.537±0.070 0.156±0.004＊＊△高 剂 量组 10 0.533±0.028 0.156±0.004＊＊△

表3 亚硝酸钠短期暴露后对小鼠附睾精子计数和精子活动力的影响（）

表3 亚硝酸钠短期暴露后对小鼠附睾精子计数和精子活动力的影响（）

＊与正常对照组比较P＜0.05

组别 例数 精子计数（×106／ml） 精子活率（%） a级精子占比（%） b级精子占比（%） c级精子占比（%）正常对照组 10 21.235±3.28 57.183±5.36 15.426±3.71 23.145±5.90 18.851±5.49本底对照组 10 15.464±2.43＊ 51.234±3.22 13.781±7.50 22.231±6.63 15.537±6.04低 剂 量组 10 14.281±3.10＊ 50.342±5.63 13.187±6.15 22.741±7.04 15.743±5.30中 剂 量组 10 15.036±3.71＊ 49.551±8.20＊ 14.541±6.52 19.987±6.27 15.622±5.44高 剂 量组 10 16.325±1.04＊ 48.497±6.91＊ 14.055±7.82 19.547±8.82 13.946±5.48＊

2.4 亚硝酸钠短期暴露对小鼠睾丸组织形态的影响

正常对照组中睾丸组织结构形态正常（图1a）。本底对照组中，睾丸组织均无明显不良变化，与正常对照组基本一致（图1b）。小鼠随着喂食亚硝酸钠剂量的增加，细精管出现病理性改变，部分曲细精管上皮排列紊乱，小鼠的睾丸出现病理性改变逐步增多，损伤逐步加强（图1c、d）。高剂量组小鼠受到明显影响，30%精曲小管内生精上皮萎缩，曲细精管中生精细胞层数减少，各级生精细胞、精子细胞和精子均减少，显示睾丸组织受到明显损伤（图1e）。

图1 亚酸钠短期暴露对小鼠睾丸组织形态的影响

3 讨论

亚硝酸盐与人们生活、生产密切相关，是一种重要的食品添加剂，常用于肉类等食品加工中，它在纺织品印染行业、医药及兽医行业中也有很广泛的应用［5］。有文献报道，不少地区的饮用水中亚硝酸盐含量超标［6－8］，加上熏制和腌制食品及快餐食品的销售量增加，致使人体接触亚硝酸盐机会增加，对人类健康的影响很值得关注。大量研究资料表明，由于亚硝酸盐的强氧化性，人摄入后可导致组织缺氧而造成中毒，如摄入量大还可造成急性死亡。人类一次性摄入0.2～0.5g亚硝酸盐可引起急性中毒，3g即可致死［9］。为此我国在《食品添加剂使用卫生标准》（GB 2760－1996）中规定了亚硝酸盐在肉类制品中的限量为≤30mg／kg、在肉类罐头中的限量为≤50mg／kg［11］。

近年来，男性生育力逐步下降，主要表现在精子密度和精液质量等方面［1］。原因涉及多方面，职业因素、药物、射线及心理影响等［3］。做为常见的环境污染物之一的亚硝酸盐广泛存在，人体每日从多种途径可以接触到亚硝酸盐，接受着长期低剂量的亚硝酸盐刺激。

本研究中当雄性小鼠使用本底剂量后，小鼠体重和肝脏系数即明显增加。随着剂量的加大，脾脏系数逐步增大，显微镜下观察肝脏、脾脏增生明显，受损严重。亚硝酸钠造成肝脏损伤的主要原因与其引发组织缺氧和自由基增多密切相关［5］。

本研究中雄性小鼠接受短期低剂量的亚硝酸钠刺激后，睾丸指数无明显变化。而附睾指数下降，附睾萎缩明显。睾丸形态分析结果显示睾丸生精细胞层数减少，睾丸组织形态受损。睾丸支持细胞是睾丸组织内重要的非生殖细胞，除了可以影响每天产生的精子数量［12］，在精子的发育过程中也具有重要的调节作用［11］。此外，附睾中精子数目和精子活率均有明显的下降，生殖功能受损。附睾除了保护、运输和贮存精子外还能分泌附睾液，其中含有激素、酶等物质，这些物质有助于精子的成熟。该结果提示亚硝酸钠可能对附睾中精子的成熟或储存过程有影响。研究中，附睾中精子数目减少，附睾指数降低，可能与睾丸产生的精子少有关，而这种精子的减少可能就是因为暴露于亚硝酸钠后导致睾丸内支持细胞受损的结果。这可能是亚硝酸钠所致生殖功能损伤的一个机制。亚硝酸盐如何导致支持细胞损伤，对其他生殖细胞和生殖器官有无影响，以及影响的机制还需要进一步研究。

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［5］ 王宁，魏刚，陈西华，等.五子衍宗丸和金匮肾气丸促进小鼠生精能力恢复基因表达谱的研究［J］.中国计划生育杂志，2012，20（5）：307－312.

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