慢病毒介导的结肠癌转移相关基因1过表达对膀胱癌T24细胞增殖侵袭能力以及对肝细胞生长因子信号通路的影响

刘良兵

1武汉大学医学院第二临床学院 432300 武汉



论 著

慢病毒介导的结肠癌转移相关基因1过表达对膀胱癌T24细胞增殖侵袭能力以及对肝细胞生长因子信号通路的影响

刘良兵1

1武汉大学医学院第二临床学院 432300 武汉

目的：观察结肠癌转移相关基因1(MACC1)对膀胱癌细胞株T24增殖、侵袭能力以及对肝细胞生长因子信号通路(HGF/c-Met)的影响。方法：构建靶向过表达MACC1基因的慢病毒载体LV-MACC1-GFP，感染膀胱癌T24细胞株，经过筛选，建立稳定过表达MACC1基因的膀胱癌T24细胞株。通过实时荧光定量 PCR、蛋白质印迹法(western blotting)分别检测MACC1、HGF、c-Met基因mRNA与蛋白表达量，噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell体外细胞侵袭实验分别研究稳定过表达MACC1基因对细胞增殖和迁移的影响。结果：与阴性对照组相比，实时荧光定量 PCR 与western blotting证实，慢病毒LV-MACC1-GFP组MACC1、HGF、c-Met mRNA与蛋白表达量皆显著升高，Transwell细胞侵袭实验显示LV-MACC1-GFP组细胞迁移能力显著增强(P<0.05)。结论：慢病毒介导稳定过表达MACC1基因能使膀胱癌T24细胞株的增殖能力及侵袭能力增强，活化HGF/c-Met通路。

膀胱癌；T24细胞；结肠癌转移相关基因1；过表达

结肠癌转移相关基因1(metastasis associated in colon cancer genes-1, MACC1)在多种肿瘤中发现可以调节肝细胞生长因子信号通路(HGF/c-met)，这种调节机制在肿瘤的增殖、侵袭、血管生成等过程发挥了不可或缺的作用[1]。在膀胱癌的组织中已经发现了MACC1与c-Met基因的表达[2]，然而研究尚未涉及到细胞水平，本研究旨在于细胞水平研究MACC1基因的表达调节HGF/c-Met通路的作用以及对膀胱癌增殖侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌细胞株T24，人永生化尿路上皮细胞SV-HUC-1购于中国科学院上海细胞库。胎牛血清、RPMI 1640培养基购于Gibco公司，兔抗人MACC1抗体购自美国Sigma公司，兔抗人HGF和c-Met多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，MACC1过表达的重组慢病毒颗粒由上海吉凯公司构建、合成。总RNA提取试剂、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR试剂盒购自武汉丁香园生物试剂有限公司，荧光实时定量PCR引物由武汉迈进有限公司设计合成，噻唑蓝(MTT)购自Promega公司，Transwell小室购自Corning公司。

1.2 细胞培养

膀胱癌T24细胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、尿路上皮SV-HUC-1细胞以含10%胎牛血清的F12K培养基培养在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养，待细胞铺满后，每3～4 d用0.25%的胰蛋白酶(含0.01% EDTA)消化、传代，取对数期细胞用于实验。细胞培养与基因转染观察待细胞融合度达 40%～60%时，按照慢病毒转染说明书操作，以MACC1基因过表达重组慢病毒颗粒(LV-MACC1-GFP)和空载体对照慢病毒颗粒(LV-GFP)分别感染膀胱癌T24细胞，作为实验组(LV-MACC1-GFP组)和过表达阴性对照组(LV-GFP组)，空白对照组细胞不做任何处理，3组常规培养，待细胞长满孔板，常规消化收集细胞样本。其次为RNA干扰实验，取对数生长期T24细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮后，以2×105个/ 孔的密度接种于6孔板中。 Lipofectamine 3000用Opti-MEM预混后，静置5 min，加入Opti-MEM稀释后的MACC1-siRNA ，序列为5'-ATCAACTGTCTGCTTCTAA-3'和阴性对照的negtive-siRNA(RNA干扰阴性对照)，序列为5'-CAACAAGATGAAGAGCACC-3，混匀后室温静置20 min。 将混合物按分组加入含T24细胞的6孔板中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，48 h后收集细胞进行后续试验。

1.3 蛋白质印迹法

根据BCA试剂盒说明书测细胞总蛋白浓度，灌制SDS聚丙烯酰胺凝胶；取40 μg的等量蛋白质样品与1×SDS凝胶加样缓冲液按1∶1混合，置10℃加热3 min使蛋白质变性，进行SDS-PAGE胶电泳分离，以90 V电转移至PVDF膜，转膜时间90 min，对照蛋白质Marker 将所需片断剪下，5%脱脂奶粉封闭2 h；加一抗，4℃ 孵育12 h，TBS洗膜3次，每次10 min; 加二抗，37℃ 孵育2 h，TBS洗膜3次，每次10 min；ECL显色，以β-actin作内对照。实验重复3次。

1.4 实时定量PCR T24细胞MACC1中的表达收集

处于对数生长期的3组细胞，按以下步骤操作：①按照TRIzol试剂说明提取总RNA，1%的琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度；②按逆转录试剂盒逆转录得cDNA，MACC1上游引物：5'-CTTGCGGAGGTCACCATAGC-3'，下游引物：5'-GATTTCCAA CAA CGGG CTCA-3'；HGF上游引物：5-'ATGCATGACCTGCAATGGG-3'，下游引物：GAGTATAGCACCATGGCCTCG；c-Met上游引物：5'-TCTTCTT CCTCG GAC TCGCT-3'，下游引物：5'-GGTGTCGTTTGGAGGTGTGT-3'；以β-actin 为内参上游引物：5，-GGGAAATC GTGCGTGACAT-3'，下游引物：5'-CTGGAA GGTGG AC AGCGAG-3'。反应条件如下：70℃ 10 min、冰浴2 min、42℃ 60 min、70℃ 10 min；③实时定量PCR(quantification real-time PCR，qRT-PCR)反应参数设置：95℃ 20 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃ 5 s，40个循环，每个样品做3个平行管，每次实验至少重复3次； 数据分析由定量PCR仪器Opticon MonitorTM Analysis software软件自动完成。

1.5 MTT比色法检测细胞增殖

取对数生长期5组细胞，5×103/孔种于96孔板。分别于接种后的第1、2、3天每组细胞取5个孔，每孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，37℃、体积分数为5% CO2继续培养4 h后弃掉各孔内的培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200 μl，低速振荡10 min使结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm波长的吸光度，每组设5个复孔，实验均重复3次。

1.6 Transwell 侵袭实验

将-20℃保存的 Matrigel基质胶，置于 4℃融化。Matrigel用无血清 RPMI 1640培养液按1∶8比例稀释后，每孔 60 μl 均匀地铺在transwell小室聚碳酯膜(8 μm孔径)内面，37℃干燥 4 h 形成模拟基质层。待成胶后，消化细胞，用含5%FBS 的RPMI 1640培养液配制4×105/ml 细胞悬液。将各组细胞悬液以200 μl体积加入transwell小室上室，下室加入600 μl 含10% FBS 的RPMI 1640培养液，每组3 复孔。常规培养 24 h 后，用棉签拭去聚碳酯膜内表面细胞，PBS 冲洗，干燥，再用 0.1%结晶紫染色 30 min，随机选取5个视野观察，计数每个视野的细胞数，取平均数，重复3次。

1.7 统计学方法

2 结果

过表达MACC1基因增加膀胱癌T24细胞MACC1、HGF、c-Met蛋白表达，MACC1抑制表达则使各目的蛋白表达降低。

Western blotting显示，较空载对照LV-GFP组和空白对照细胞组比较，LV-MACC1-GFP组MACC1、HGF、c-Met蛋白表达显著增高，空载对照LV-GFP组和空白对照细胞组比较则无明显不同(图1)。

过表达MACC1基因增加膀胱癌T24细胞生长活性，MTT结果显示，与空白对照组比较，在各个时间点，LV-MACC1-GFP组细胞增殖能力明显升高(P<0.05)，而MACC1基因抑制表达则使细胞增殖明显降低(P>0.05)(图2)。

实时定量PCR显示，T24细胞与SV-HUC-1相比，MACC1、HGF、c-Met基因表达水平皆明显升高(P<0.05)(图3)。

过表达MACC1基因增加膀胱癌T24细胞MACC1、HGF、c-Met mRNA水平的表达，而MACC1-SiRNA可以明显抑制MACC1基因荧光表达，且HGF和c-MetmRNA表达也随之下降。

定量PCR实验结果显示在LV-MACC1-GFP组细胞中，MACC1、HGF、c-Met mRNA的表达LV-GFP组、空白对照细胞组及negtive-SiRNA组显著增高(P<0.001)。而空载对照LV-GFP组和空白对照细胞组和negtive-SiRNA之间各基因mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

MACC1基因过表达质粒对T24细胞体外侵袭能力的影响，与空白对照组T24细胞的穿膜细胞数(102.7±7.8)，LV-GFP组穿膜细胞数(103.9±8.4)和negtive-SiRNA组(103.9±8.1)比较，LV-MACC1-GFP转染组的穿膜细胞数(278.4±24.8)显著增多 (P<0.05)，而抑制MACC1表达后，则使穿膜细胞数显著降低(50.9±5.2)。

图1 5组细胞各蛋白相对表达量

图2 5组细胞MTT增殖曲线

图3 MACC1、c-Met、HGF基因在T24细胞与HV-SUC1细胞的表达

1：LV-MACC1-GFP组；2：LV-GFP组；3：空白对照；4：MACC1-SiRNA；5：negtive-SiRNA。

图4 MACC1过表达与抑制表达各基因相对表达量的比较

A：LV-MACC1-GFP组；B：LV-GFP组；C：空白对照组；D：MACC1-SiRNA组；E：negtive-SiRNA组。

图5 5组细胞transwell侵袭实验结果

3 讨论

本研究发现人膀胱癌 T24细胞存在MACC1的表达，并且通过质粒转染使MACC1在T24细胞中过表达，可以显著提高T24细胞的增殖与侵袭能力，并且可以显著提高在HGF/c-met信号通路中HGF与c-met的表达，故而本研究表明，MACC1的高表达在膀胱癌的发生、进展、转移侵袭的过程中起到了促进作用。

MACCl基因是首次在结肠癌的研究中被鉴定发现，其基因定位于人类7号染色体(7p21.1)，在结肠癌的增殖、分化、侵袭的过程中起到了重要的作用，多项研究表明MACC1发挥作用主要通过激活HGF/c-met信号通路的激活而达成[3]。MACC1是HGF/c-met信号通路的关键调控因子，可以明显的上调c-met基因的表达，与HGF协同作用，共同显著地促进肿瘤细胞的侵袭和转移[4～6]。而本研究通过细胞实验首次在膀胱癌中证实了MACC1对HGF/c-met信号通路相关基因表达的促进作用。

研究表明，HGF/c-met信号通路激活可以促进细胞生长、血管生成，并且广泛参与了上皮细胞间质转化的过程。在HGF/c-met信号通路中，HGF与其受体c-met特异性结合后，使c-met产生自身磷酸化反应，引起级联瀑布式磷酸化反应，将信号放大传递至细胞核内，从而促进细胞的增殖HGF/c-met信号通路通过诱导基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease, MMP)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达，促进肿瘤破坏正常基质与加强肿瘤生血管的作用，从而引起肿瘤的生长和转移。并且有研究表明MACC1与HGF/c-met还存在正反馈协同促进的作用，MACC1的表达可以促进c-met基因表达，进而活化HGF从而共同促进肿瘤增殖转移的作用，而HGF作用的活化，又反过来可以促进MACC1基因的表达[5，7]。

根据文献报道，MACC1正常人体组织表达水平很低，而在许多肿瘤组织中表达则相对较高，并且MACC1的表达水平与肿瘤的增殖、转移强相关，并影响肿瘤患者的预后结果。在结肠癌[3]、肝癌[4]、卵巢癌[8]的研究中皆证实，MACC1的高表达会导致预后结果不佳，这表明MACC1的表达可以作为肿瘤诊断和判断预后的标志物。

目前，膀胱癌的化疗虽有改进，但与其他系统肿瘤相比化疗效果仍旧不理想[9]，分子靶向治疗已成为一个膀胱癌临床治疗的新的热点，c-met基因已经被作为肿瘤靶向治疗和基因治疗的靶点而得到深入的研究[10]，本项研究表明MACC1表达升高引起肿瘤的增殖以及侵袭力提高，并导致c-met与HGF基因表达升高，尽管如此，对MACC1的研究可为治疗膀胱癌开辟新的路径和提供新的治疗靶点，提供新的思路。

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Lentivirus-mediated over-expression of MACC1 accelerates proliferation and invasion of bladder carcinoma T24 cells andactivates hepatocyte growth factor /c-Met pathway

LiuLiangbing1

(1Department of Urology, the Second Clinical Medical College of Wuhan University, Wuhan 432300, China)

Liu Liangbing, lucan750@163.com

Objective: To investigate the effects of MACC1 on proliferation and invasion of T24 cells. Methods: MACC1 gene coding region was cloned into lentivirus vector, and lentivirus particles were infected into the human bladder carcinoma cell line T24 to upregulate the expression of MACC1 gene. The up-regulated efficiency of targeting MACC1 gene at mRNA level was detected by real-time quantitative PCR, the effect on proliferation of T24 cells was assayed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay and the invasion ability was detected by transwell motility assay. Results: The lentiviral vector targeting MACC1 gene was constructed successfully, and a stable human bladder cancer cell line T24 line that up-regulated MACC1 was established. Quantitative real-time PCR and Western blotting results showed that the expression of MACC1, HGF, and c-Met gene was efficiently up-regulated by infecting LV-MACC1-GFP (P<0.05). The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay and growth curve showed that the over-expression of the MACC1 gene successfully increased the proliferative capability of T24 cells. The transwell assay also showed similar increasing results on the migration ability (P<0.001). The number of transmembrane cells in LV-MACC1-GFP group was 230.3% of blank control group. Conclusions: The MACC1 gene plays a significant role in the proliferation and migration abilities of human bladder cancer cell line T24.

bladder carcinoma; T24 cells; metastasis associated in colon cancer -1; overexpression

刘良兵，lucan750@163.com

2015-07-12

R737.14

A

2095-5146(2015)06-372-05