肾透明细胞癌中碳酸酐酶IX 与Pten蛋白的表达与意义

刘贝贝，梁朝朝△，刘建民，承泽农

（1.安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，合肥230032；2.蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科，安徽蚌埠233004；3.蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽蚌埠233004）

肾癌是临床上常见的泌尿系恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高，发病率在泌尿系肿瘤中仅次于膀胱癌［1］。肾癌比较隐匿，当出现临床症状时多数病情诊断已到晚期。对肾细胞癌的治疗，早期发现肿瘤的原发灶和转移灶非常重要，而肾癌早期一般无明显症状，目前影像学方法诊断肾癌的特异性和敏感性较差。肾癌的主要病理类型为肾透明细胞癌，占60%～85%［2］。近年来，多项研究报告碳酸酐酶IX 与Pten蛋白的表达可能参与肿瘤的发生发展。本文分析研究碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌中的表达情况，碳酸酐酶IX 与Pten蛋白的表达与肾癌的临床病理特征均具有相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取安徽医科大学第一附属医院2012年6月至2013年6月经病理证实为肾透明细胞癌组织98例，男64例（65.31%），女34 例（34.69%）；年 龄20～68 岁，平 均（31.3±18.6）岁，肿瘤直径大小2.1～12.2cm，平均（6.7±4.3）cm，左肾癌54例（55.10%），右肾癌44例（44.90%）。组织学Fuhrman 分级：Ⅰ级39例，Ⅱ级44例，Ⅲ～Ⅳ级15例。淋巴结无转移82 例，转移16例。根据2009年美国癌症联合委员会（AJCC）的TNM 分期标准分期：Ⅰ期33 例，Ⅱ期47 例，Ⅲ～Ⅳ期18例。同时经病理证实为正常肾组织15例作为对照组［3］。所有组织标本均用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，3μm 厚度连续切片。

1.2 试剂 兔抗人碳酸酐酶IX 单克隆抗体购自Abcam 公司，山羊抗人Pten多克隆抗体购自美国A.B.ROOM 公司。二氨基联苯胺（DAB）显色剂、免疫组织化学SP法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，国产分析纯试剂乙醇、二甲苯等，国产磷酸盐缓冲液（PBS）等。

1.3 方法 采用免疫组织化学SP 法：将所有标本用10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，以3μm 厚度连续切片，放于多聚赖氨酸玻片上，在65 ℃烤箱中烘烤过夜，次日取出，选用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，选用3% H2O2孵化20 min，洗涤，置于0.01mol／L枸缘酸缓冲液内煮沸，自然冷却，洗涤；滴入羊血清封闭，一抗，孵化过夜，洗涤；二抗，孵化30min，洗涤；滴入辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素工作液，孵化30min，洗涤；BAD 染色，苏木素复染，脱水，干燥，封片，镜检。

1.4 结果判断 阴性对照为PBS 缓冲液（0.01μmol／L pH＝7.40～7.60）代替一抗，将已知表达阳性的肾透明细胞癌组织切片作为阳性对照。碳酸酐酶IX、Pten蛋白的阳性表达主要定位在细胞膜或细胞质中，细胞呈现明显棕黄色为阳性细胞。据染色细胞百分率及细胞膜染色程度进行分析评分。（1）阳性细胞百分比评分：在高倍镜视野（×400）下，随机选择10个视野，每个视野计算100 个细胞，然后计算阳性细胞百分率，4分为阳性细胞大于75%，3分为51%～75%，2分为26%～50%，1分为阳性细胞6%～25%，0分为小于5%。（2）染色强度评分：3分为棕褐色，2分为棕黄色，1分为淡黄色，0分为无色。依据两种评分总和作出判断：≤3分为阴性（-），4～5分为弱阳性（＋），6～7分为强阳性（＋＋）［4］。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，采用Spearman等级相关分析检验相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌组织和正常肾组织的表达情况 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌中的阳性表达率分别为72.45%（71／98）和42.86%（42／98），碳酸酐酶IX 在正常肾组织中无一例表达，Pten蛋白在正常肾组织中100%表达，碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌组织和正常肾组织的表达情况差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白与临床病理特征的相关性 碳酸酐酶IX 的表达与患者年龄分布、肿瘤直径大小、TNM 分期、Fuhrman 分级、有无淋巴结转移等因素无关。Pten蛋白在肾透明细胞癌中的表达与患者年龄分布、肿瘤直径大小因素无关，而有淋巴结转移患者中的阳性表达率明显低于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。在组织学Fuhrman病理分级中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率分别为71.79%、36.36%、0，呈递减趋势（r＝-0.387，P＜0.01）；在临床分期中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率分别为81.82%、53.19%、5.56%，呈递减趋势（r＝-0.314，P＜0.01），见表2。

表1 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌组织和 正常肾组织的表达情况［n（%）］

表2 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌中的表达情况［n（%）］

续表2 碳酸酐酶IX 与Pten蛋白在肾透明细胞癌中的表达情况［n（%）］

3 讨 论

肾透明细胞癌是临床上最常见的肾脏恶性肿瘤，其发病率占肾癌的60%～85%。肾透明细胞癌的早期临床症状非常隐匿，目前临床诊断方法主要为B 超、CT、MRI等影像方法，大部分患者在初诊时肾癌已经发生转移［5］。由于肾透明细胞癌对放疗及化疗不敏感，临床治疗主要通过手术治疗，但是已经发生转移的晚期肾癌一般过了最佳手术时间，未转移早期进展期肾细胞癌患者经根治术后依然有20%～40%会发生转移、复发［6］。因此对于寻找能够预测预后、诊断、治疗肾透明细胞癌的标记分子显得非常重要。近年来，随着肾肿瘤分子生物学研究的快速发展，其中碳酸酐酶IX 与Pten蛋白能够成为诊断进展期肾细胞癌、预测预后及治疗反应的新指标和治疗的新靶点。

碳酸酐酶IX 是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，为碳酸酐酶家族的一员，主要定位于细胞膜上，能可逆催化CO2水化，生成H＋和HCO3-，HCO3-与细胞内Cl-交换来维持细胞内碱性环境，细胞内H＋通过H＋-Na＋离子泵方式运输到细胞外，将细胞外变为酸性环境［7］。碳酸酐酶IX 在大部分正常组织中不表达或低表达，而在肾透明细胞癌中高表达，这也是造成肿瘤酸性微环境的形成的一个重要因素，且碳酸酐酶IX 可能参与肿瘤的发生发展［8］。关于透明细胞系肾细胞癌中的碳酸酐酶IX 表达是否与病理分级、临床分期、组织学类型、转移情况及肿瘤大小有关一直存在争议。有研究结果表明肾透明细胞癌中碳酸酐酶IX 的表达与肿瘤的TMN 分期、Fuhrma病理分级或转移情况无关。但是，杨珊珊等［9］采用Meta分析碳酸酐酶IX 高表达与肾透明细胞癌Fuhrma病理分级、临床分期的关系，得出结论为碳酸酐酶IX 高表达同透明细胞系肾细胞癌分级与分期有一定相关性，且呈负相关［9］。本文结果显示，碳酸酐酶IX 的表达与患者年龄分布、肿瘤直径大小、临床分期、Fuhrman病理分级、淋巴结转移情况等因素无关，这可能与本研究方法、样本量和研究人群及判断方法的差异不同导致，本文碳酸酐酶IX 结果按阳性、阴性区分，而不是高、低表达分开。但是多项研究结果显示碳酸酐酶IX 可以作为肿瘤分子标记物用于进展期肾细胞癌的预后判断［10］。

Pten蛋白是由Pten基因编码的一类具有磷酸酯酶活性的蛋白质，其能拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。目前多项研究表明，胶质母细胞瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多种肿瘤中存在Pten基因异常，因此认为Pten 基因一种非常重要的抑癌基因［4］。而Pten蛋白在肾透明细胞癌中的表达情况的研究较少，本文结果发现在98例肾透明细胞癌组织中的不同大小肿瘤、不同年龄方面的Pten蛋白的阳性表达率差异无统计学意义（均P＞0.05）。有无淋巴结转移、病理分级及临床分期方面的Pten蛋白的阳性表达率差异有统计学意义（均P＜0.05）。且Pten蛋白的表达与肾透明细胞癌的临床分期、Fuhrman病理分级呈负相关（r＝-0.314，P＜0.01；r＝-0.387，P＜0.01）。因此，Pten蛋白的检测有助于肾透明细胞癌的临床分期、Fuhrman病理分级的判断，其对肾透明细胞癌的诊断、治疗、预后均具有重要意义。

综上所述，碳酸酐酶IX 有助于肾透明细胞癌的诊断，Pten蛋白的表达与肾癌的临床病理特征具有相关性，联合检测有助于肾癌的病情判断及预后评估。

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